[生物学]第六章酶分子工程概述.pptVIP

第六章 酶的分子工程 之一：概述 第一节 酶的分子工程 酶的分子工程 —— molecular engineering of the enzyme 主要指化学或分子生物学方法对酶分子进行改造 分两部分： 对天然酶分子进行改造，包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等 分子生物学水平，即用基因工程方法对DNA或RNA进行分子改造，以获得化学结构更为合理的酶蛋白 1、化学酶工程 生物酶工程： 克隆酶 突变酶 新酶 最成功的例子： 人纤维蛋白溶酶原激活剂 促进溶解血块中的纤维蛋白。临床上用于治疗血栓性疾病，促进体内血栓的溶解。 利用工程菌株生产的纤维蛋白溶酶原激活剂在疗效上与人体合成的酶完全一效，目前已用于临床试验。 凝乳蛋白酶 生产乳酪的必需用酶，其来源有限。 人们克隆了小牛凝乳酶基因在酵母系统中表达，得到的凝乳酶与从小牛胃中提取的天然酶性质完全一致。 第二节 酶蛋白的稳定性和稳定化 酶的稳定性（enzyme stability） 是指酶分子抵抗各种不利因素影响，维持一定空间结构，保持生物活性相对稳定的能力。 在细胞内，酶分子受到内膜系统保护，而且处于还原性环境，不易被氧化失活。 而酶工程所涉及的催化过程几乎都在体外，条件比细胞内环境恶劣得多，酶不稳定的缺点显得尤其突出。 一、蛋白质稳定性的分子原因 稳定的空间结构是酶催化活性稳定的基础 从分子水平上看 一级结构：肽键和二硫键。 酶分子空间结构通常比一级结构更为脆弱，非共价键包括疏水键、氢键、离子键、范德华力、金属离子结合等。 蛋白质稳定性的分子原因： A: 金属离子、底物、辅助因子和其他相对分子质量配体的结合作用 金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处），因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其它低分子量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。这是因为蛋白质与上述效应子的作用常使蛋白质发生构象变化，使其构象更稳定。 B:蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物，从而显著增加蛋白质稳定性。这是因为蛋白质分子表面上既有疏水簇，也有极性和带电基团。从热力学上看，疏水簇与水的接触对蛋白质稳定性是不利的。当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域 D：二硫键 引入二硫键 研究发现，在酶蛋白中引入半胱氨酸，从而增加酶蛋白中二硫键的数量可以增加某些酶的稳定性，但不影响酶的活性。 Tumnen等报道将Trichoderma reesei的木聚糖酶II的一个α-螺旋中的Ser-110和Asp-154分别突变为Cys，从而在110位和154位建立一个二硫键， 65℃时的半衰期从不到1min增加到14min。 Wakarchuk等在木聚糖酶分子中引入不影响其活性的二硫键，使其耐热性提高了15℃。 用二硫键稳定蛋白质的思想来自于聚合物化学。五十年代中期已经证明，大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高其在溶液中的稳定性。稳定化指的是熵性质：由于交联即蛋白质中形成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低，因而天然蛋白和变性蛋白的自由能间的差别增加。这个稳定化效应值随着肽链中氨基酸数目的增加而增加。类似的，用双功能试剂实现分子内交联，也能使蛋白质构象稳定化，这点我们在后面还会提到。 E：疏水相互作用 对蛋白质的稳定性非常重要 增加疏水作用数目是稳定蛋白质的实用方法。 降低蛋白质表面的疏水性质； 增加蛋白质内部的疏水性。 从实验上看，可用定点突变或化学修饰来实现这个目的。 F：对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸）的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。 半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别敏感 因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显著偏低 MAPK 磷酸酶（MPKs）削弱应激激活的MAPK 信号传递。MPK含有一个半胱氨酸巯基（sulfhydryl group），决定其催化活性。如果该基团在活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）下发生氧化，MPK活性不可逆地消失 G：氨基酸残基的坚实装配 蛋白质结构中仍有空隙,通常为水分子所充满。分子量为2―3万的蛋白质中约有个5―15水分子 ，会导致蛋白质不稳定。 溶液中的蛋白质似乎装配紧密，其紧密程度类似于低分子量化合物的晶体状态。尽管如此，蛋白质结构中仍有空隙。按照Chothia说法，蛋白球体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充满。由布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触当然会导致蛋白质不稳定。随着水