[研究生入学考试]杨建雄生化789章.docVIP

蛋白质分离、纯化和表征 第七章 1．掌握蛋白质的酸碱性质。 2．掌握测定蛋白质相对分子质量的常用方法。 3．掌握蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀的方法和原理。 4．掌握蛋白质分离纯化的一般原则。 5．熟悉蛋白质分离纯化的常用方法。 6．掌握蛋白质含量测定与纯度鉴定的常用方法。 第七章作业 1．测得一种血红素蛋白含0.426%铁，计算其最低相对分子质量。一种纯酶按重量计算含亮氨酸1.65%和异亮氨酸2.48%，问其最低相对分子质量是多少？ 2．超速离心机的转速为58000r/min时，（1）计算角速度w，以每秒的弧度（rad/s）表示；（2）计算距旋转中心6.2cm处的离心加速度a；（3）此离心加速度相当于重力加速度“g”的多少倍？ 3．一种蛋白质的偏微比容为0.707cm3/g；当温度校正为水时，扩散系数（D20，w）为13.1×10-7cm2/s；沉降系数（D20，w）为2.05 S，20℃时水的密度为0.998g/cm3。根据斯维德贝格公式计算该蛋白质的相对分子质量。 4．指出从分子排阻层析柱上洗脱下列蛋白质时的顺序。分离蛋白质的范围是5000到400000：肌红蛋白，过氧化氢酶，细胞色素c，肌球蛋白，胰凝乳蛋白酶原和血清清蛋白（它们的Mr，见表7-4）。 5．在第4题中所述的从分子排阻层析柱上洗脱细胞色素c，β-乳球蛋白，未知蛋白和血红蛋白时，其洗脱体积分别为118，58，37和24ml，问未知蛋白的Mr是多少？假定所有蛋白质都是球形的，并且都处在柱的分级分离范围内。 6．在下面指出的pH下，下述蛋白质在电场中向哪个方向移动，即向正极，负极还是不动？（根据表7-2的数据判断）。（1）卵清蛋白，在PH5.0；（2）β-乳球蛋白，在PH 5.0和7.0；（3）胰凝乳蛋白酶原，在PH5.0，9.1和11。 7．（1）当Ala，Ser，Phe，Leu，Arg，Asp和His的混合物在PH3.9进行纸电泳时，哪些氨基酸移向正极？哪些氨基酸移向负极？ （2）纸电泳时，带有相同电荷的氨基酸常有少许分开，例如Gly可与Leu分开。试说明为什么？ （3）设Ala，Val，Glu，Lys和Thr的混合物PH为6.0，试指出纸电泳后氨基酸的分离情况。 8．配置一系列牛血清清蛋白（BSA）稀释液，每一种溶液取0.1ml进行Bradford法测定。对适当的空白测定595nm波长处的光吸收（A595）。结果如下表所示： BSA的浓度/（mg×mL-1） A595 1.5 1.4 1.0 0.97 0.8 0.79 0.6 0.59 0.4 0.37 0.2 0.17 BSA浓度对A595作图得标准曲线。E.coli的蛋白质提取液样品（0.1ml）测得的A595的0.84。根据标准曲线算出E.coli提取液中的蛋白质浓度。 9．今有一种植物的毒素蛋白。直接用SDS凝胶电泳分析（见第7章）时，它的区带位于肌红蛋白（相对分子质量为16900）和β-乳球蛋白（相对分子质量37100）两种蛋白之间，当这个毒素蛋白用β-巯基乙醇和碘乙酸处理后，在SDS凝胶电泳中仍得到一条区带，但其位置靠近标记蛋白细胞色素c（相对分子质量为13370）。进一步实验表明，该毒素蛋白与FDNB反应并酸水解后，释放出游离的DNP-Gly和DNP-Tyr。关于此蛋白的结构，你能作出什么结论？ 点击放大 第一节　蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的pK值与游离氨基酸的不完全相同。 等电点要用等电聚焦等方法测定。 第二节　蛋白质分子的大小与形状 一、根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。 例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100( 131)/1.65=7939.4。 按照Ile的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100( 131)/2.48=5282.3。 由于X1和X2数字差异较大，提示这种酶含Leu和Ile不止1个，为了估算Leu和Ile的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2个Leu，3个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 (2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。 二、渗透压法测定相对分子质量 三、沉降分析法测定相对分子质量 点击放大 基本原理： （一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子