实时定量定量PCR探针-赛百盛.PDFVIP

实时定量PCR 探针 (Real-timePCRProbes)概述 实时定量PCR (qPCR)的优势  实时检测PCR反应过程  精确计算出每个循环的PCR产物量  扩增和检测同时进行  消除后续PCR 的干扰 在实时定量PCR反应中，杂交探针与插入染料如SYBRGreen相比是更好的选择。荧 光标记探针可以提高实时定量PCR结果的效率、灵敏度和特异性。而且定量PCR可以在 一个反应里同时检测多个目标基因。 实时定量PCR 的应用  基因表达分析  转基因检测和定量  病原体检测和定量  基因型/ SNP分析  突变检测 多重PCR分析的优点  省钱省时省力  所需样品量少  消除移液误差  可以在一个反应里设置内部对照  便于筛选 双标探针的原理 PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一线性的 寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发 射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；PCR 扩增时（在延伸阶段）， Taq 酶的 5 － 3 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从 而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实 现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。 荧光共振能量转移(FRET)技术的原理 两条线性寡核苷酸探针，其中一条的 3 ‘端标记荧光激发基团，另一条的 5 端标记荧 光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能 检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在 PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得 两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号 的强弱代表了靶序列的多少。 分子信标的原理 分子信标技术是在同一探针的两末端分别标记荧光基团和淬灭基团，为一种标记荧光的 发夹探针。在未与模板发生杂交前该探针分子呈发夹结构，结合在其两端的荧光基团距离上 接近，产生能量转移效应，不发生荧光。当该探针与模板杂交，使荧光基团与淬灭荧光基团 彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧 光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析。 下表列出的是最常用的荧光基团及与之匹配的淬灭基团 Spectral Properties Table Color Max. Max. Compatible Dye EX (nm) EM (nm) Quencher 6-FAM Green 492 515 BHQ-1,TAMRA JOE Orange 520 548 BHQ-1,TAMRA TET Orange 521 536 BHQ-1,TAMRA HEX Pink 535 556 BHQ-1,TAMRA TAMRA Rose 556 580 BHQ-2 Cy3 Red 552 570 BHQ-2 ROX Red 587 607 BHQ-2 Cy5 Violet 643 667 BHQ-2, BHQ-3 由于NED，VIC，PET 等荧光素的专利归Perkin Elmer公司所有，所以我们推荐以下 可替代的荧光素： Dye Excitation Emission V