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四、质粒的分离、检测与纯化 质粒DNA的构型 三种不同的构型： 共价闭合环形DNA(cccDNA)：两条核苷酸链均保持着完整的环形结构，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 开环DNA(ocDNA)：两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口。 若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L构型。 第四节 质粒的复制和调节 一、质粒的大小拷贝数 1. 复制的方式 与复制有关的蛋白质基因位于他们的作用位点处（ori）， 因此此部分不可缺。 ori区域决定质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。 三、质粒复制调控 ColE1质粒DNA的复制，是从一个特定的复制起点（oriV）开始，并沿着环DNA分子单向性地进行。 控制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素RNAI和RNAⅡ两种RNA分子，都是由ColE1 DNA转录产生的。 其中RNAⅡ也叫做复制引物。 除RNAⅠ外，另外一种调控是Rop蛋白，由质粒编码。 Rop蛋白质可提高RNAⅠ与RNAⅡ结合的效率。ROp蛋白通过促进RNAⅠ和RNAⅡ杂交体的形成，增强RNAⅠ的负调节作用。 因此，rom/rop基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高两个数量级。例如，rom /rop基因的缺失可使较早期组建的载体pBR322在每个细菌细胞中的质粒拷贝数从15~20个增至500个以上，在ram/rop基因中插入一段外源DNA片段，则可导致致死性的大量质粒DNA复制。 例如 ：在无选择条件下，细菌生长几代之后，占少数的质粒可能在菌落的某些细胞中丧失殆尽。在原始细胞的后代中可含有两种质粒中的任意一种，但极少兼而有之。 不同构型质粒DNA电泳移动速度比较 2. 氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心 ①质粒DNA占总DNA的1%～2%； ②在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态； ③染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。 流程： 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。 将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链的碱基中去。 在EB达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。 3.电镜观察 1 质粒的大小 　 常用分子质量MD或碱基对数kb来表示，1MD的双链DNA≈1.65kb。 　 测定方法： ⑴ 与标准质粒比较，以电泳距离作图估算。 ⑵ 限制性内切酶酶切，与标准DNA酶切片段电泳对比。 ⑶ 电镜照片量DNA长度 ⑷ 测序。 根据质粒的复制特性分为两大类： 　　 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒，每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 　　 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒，20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。 2 质粒的拷贝数 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细胞中存在的数目。 二、质粒复制 质粒作为独立的复制子。复制起点叫做oriV，复制方式有θ和滚环两种方式，多以θ方式复制。 质粒只编码几种蛋白质，其它的都有寄主提供。 复制子是一个复制单位，细菌染色体和质粒都是一个复制子。复制至少需要一个复制起点。 单向复制 双向复制 滚环复制 2 复制起点 质粒DNA大部分区域被去掉，ori序列被保留，且是环状，则质粒任然能进行复制。 氨苄青霉素抗性基因（ampr）来源于转座子Tn3 pBR322是一个人工构建的重要质粒，“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。 DNA复制起点（ori）来源于pMB1质粒 四环素抗性基因（tetr）来源于pSC101 质粒调控一般采用负调控机制，负调控因子可以是蛋白质、RNA或DNA重复序列。 两种调控机制： 抑制物-靶位调控 重复子-竞争结合调控 1 抑制物-靶位调控 依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通过他与目标RNA的互补结合阻止质粒复制。 目标RNA是质粒DNA复制的引物或是用于编码复制所需的Rep蛋白的mRNA。 （1）colE1质粒复制调控 ?proteins for mobil