实验一 核酸提取及琼脂糖电泳.ppt

核酸提取及琼脂糖电泳 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。 DNA提取的几种方法 　染色体DNA的提取 基因组DNA－ CTAB法 　CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） 基因组DNA－ CTAB法 　CTAB提取缓冲液的经典配方 　CTAB提取缓冲液的改进配方 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 　CTAB法流程图 基因组DNA－SDS法 SDS法流程图 （以动物组织为例） 基因组DNA－其它方法 　根据细胞裂解方式的不同有： 　吸附材料结合法： 基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　　　 　 　有机溶剂抽提法： 　　　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 DNA提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸沉淀、溶解 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 动物组织细胞基因组DNA提取 2. 试剂： 1、 TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。 2、 裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至 100mg/ml。 3、 20% SDS 4、 2mg/ml蛋白酶K 5、 Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿/异戊醇 6、 无水乙醇、75%乙醇 7、 TAE电泳缓冲液 实验操作 材料处理1、 新鲜或冰冻组织处理 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。 加20% SDS 25μl，蛋白酶K (2mg/ml) 25μl，混匀。 65°C水浴30min。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。 DNA提取 加等量的酚/氯仿/异戊醇至上述样品处理液中振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 取上层溶液至另一管，加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。。 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，10min。 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。 DNA及RNA含量测定 DNA及RNA含量测定 取少量待测DNA(RNA)样品，用TE或蒸馏水稀释50倍（或100倍）。 用TE或蒸馏水做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。 加入待测DNA(RNA)样品在三个波长处读取OD值。 纯DNA样品的OD260/OD280 大约为1.8，高于1.8可能有RNA污染，低于1.8有蛋白质污染；纯RNA 样品的OD260/OD280 大约为2.0。 根据OD值计算DNA（RNA）浓度或纯度。 [SSDNA]=33×（OD260-OD310）×稀释倍数 [dSDNA]=50×（OD260-OD310）×稀释倍数 [SSRNA]=40×（OD260-OD310）×稀释倍数 琼脂糖凝胶的特点 天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸: 如重组质粒的鉴定，DNA酶谱制作等。 琼脂糖电泳优点： 操作简单，电泳速度快，样品处理容易。 样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。（琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电泳，样品扩散较自由。） 无紫外吸收，可直接用紫外光灯检测及定量测定。 易染色，易洗脱样品，便于定量测定。制成干膜可长期保存。???? 琼脂糖电泳注意问题 融胶时非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。 倒胶的时候制胶的桌面相对水平。倒胶时尽