[农学]植物细胞培养.ppt

Fujimura分离胡萝卜悬浮液 悬浮液 47μm膜过滤 滤液 31μm膜过滤 收集 网上细胞 加入等体积的培养基 加入到10%-18%的Ficoll 180g离心5min 收集各细胞层的细胞 用培养基洗涤 分别接种 （2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。 常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。（3）有丝分裂阻抑 用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜。 4.2.4 悬浮细胞的同步化 （4）饥饿法  悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。 （5）冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度  4.2.4 悬浮细胞的同步化 无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。用于处理的细胞系最好处于对数生长期。 4.2.4 悬浮细胞的同步化 4.3 单细胞培养技术 （1）建立单细胞无性系 悬浮培养细胞间细胞间在遗传、生理和生化上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、高品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。（2）排除体细胞的干扰（3）利于对细胞活动跟踪观察 4.3.1 植物单细胞培养的意义 (1)细胞平板培养 概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养。 主要技术要点：? ①单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。? ②单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml。 4.3.2 单细胞培养的方法 ③植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺于培养皿中，其厚度为1-2mm。? 待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或parafilm封口膜将培养皿封严以防污染，在25℃黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。 ④植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。  植板率(％)＝(形成的细胞团数/接种的细胞数)×100％ 计算式中每个平板新形成的细胞团数的计数方法有两种：一是直接计数法，注意计量时要掌握合适的时间，即细胞团肉眼已能分辨，但尚未长合到一起的时候。二是感光法，在暗室的红光下将一印相纸放于欲计数的培养皿下，其上放一光源使培养皿中细胞团印到相纸上，冲洗照片计数。 （2）看护培养 概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。 4.3.2 单细胞培养的方法 （3）微室培养 概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。 4.3.2 单细胞培养的方法 特点：（1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程；（2）培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。 （4）其它单细胞培养技术 A 饲养层培养基技术 将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞起到一个饲养作用。 B 双层滤纸植板培养方法 培养基 饲养层细胞 看护滤纸层 转移碟滤纸 培养细胞 4.3.2 单细胞培养的方法 4.4.1 概述 4.4.2 培养系统 4.4.3 植物细胞规模培养技术要点技术要点? 4.4.4 提高细胞次生代谢产物的途径 4.4.5 细胞规模化培养中的有关技术问题 4.4 植物细胞大规模培养 与次生代谢产物生产 4.4.1 概述 植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。 （1） 植物产生代谢产物的类型 植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种），根据分子结构不同大致分为： 酚类化合物－黄酮类 单酚类 醌 类（苯醌、萘醌、蒽醌） 萜类化合物－三萜皂甙