[农学]第三章基因工程载体.ppt

第三章 基 因 工 程 载 体 DNA分子。 二、载体特点 三、载体种类 克隆载体（plasmid) 表达载体 特殊用途载体 一、克隆载体 1.定义 克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体。 目前常用的克隆质粒载体有pBR322、pUC及其派生质粒载体。 2、克隆载体基本条件： 对受体细胞具有转移性， 具有多克隆位点（MCS）， 具合适的选择标记基因 ， 可在宿主细胞中自主复制和表达。 3、克隆载体的种类 质粒载体（plasmid vector) 噬菌体载体(phage vector) 黏粒载体(cosmid vector) 人工染色体（artifical chromosome) 二、 质粒载体 1、定义: 质粒是染色体外能够自主复制的双链闭合环状DNA分子。 细菌、蓝藻、霉菌、酵母甚至真菌细胞中都发现。 2、质粒DNA的基本性质 （2）复制特性 质粒DNA有自己的复制起始区（ori)及相关的顺式作用元件（ciselement) 严紧型 1-3个拷贝 松弛型 10-200个拷贝 （3）质粒的不亲和性 两种不同质粒不能在同一个宿主细胞系中稳定地的共存的现象。 亲缘关系密切的不同质粒一般属于不相质粒。 （4）质粒的转移性 质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。 类型： 结合型：可自我转移，大多为严紧型质粒 非结合型：不可自我转移，大多为松弛型质粒 3、质粒载体的构建 （1）.天然质粒用作载体的局限性 天然质粒是指没有经过体外修饰改造的质粒 具有分子量大，克隆能力低，拷贝数低，提取难度大，克隆位点有限，编码基因具免疫筛选等不足之处。 （2）载体构建策略 选择合适的复制起始点 加入合适的选择标记基因 增加或减少酶切位点 缩短分子大小 4、常用的质粒载体 （1）pBR322及其派生的质粒载体 1.PBR322的一般生物学特性 a PBR322 大小为4.363kb 为松弛型质粒，复制起始点来源于pMB1 b 四环素抗性基因（Tet r)来源于pSC101 c 氨苄青霉素抗性基因（ Amp r）来源于pSF2124 d 12 种限制性内切酶的单一识别位点。分别位于Tet r 和Amp r中 2.PBR322的优点 a 分子量小 4363bp 统一规定记数从EcoRI识别位点GAATTC的第一个T为1 b 两种抗生素抗性基因，可作为重组体的选择标记，便于筛选重组体。 Tetr 基因内有7个酶切位点， Ampr 基因内有3 个酶切位点， Ori内有2个酶切位点 插入失活：因插入外源DNA 片段而使基因失活的现象 c 具有较高的拷贝数 1000-3000/细胞 （2）. pUC系列的质粒载体 pUC质粒载体的特点: 1.具有更小的分子量 pUC8/ pUC9 2750bp pUC/18 pUC19 2686bp 2.利用组织化学法筛选重组体 3.具有多克隆位点 4.具有更高的拷贝数 （3）T载体 PCR产物的3’端由一个非配对的脱氧腺嘌呤（A）。 根据这一点研制的线性TA质粒载体，在5’端带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶（T）,用于PCR产物的直接克隆。 三、 噬菌体载体 噬菌体是细菌病毒的总称，通过感染，病毒颗粒可进入宿主细胞实现外源DNA的导入。 1.λ噬菌体载体 （1）λ噬菌体的性质 λ噬菌体DNA为环状双链分子，长度为48.5kb 调节基因、重组基因、复制基因、结构基因四个基因簇 有56种限制性内切酶的识别位点 两端有12bp的单链互补的粘性末端，可结合形成双链区段（COS位点）是包装的必需DNA序列。 （2）噬菌体载体的构建 λ噬菌体的改造 切除非必需区段（重组基因簇） 切除必需的的RE识别位点，在非必需区引入合适的RE识别位点 引入适当的选择标记基因以便重组子的筛选 建立重组λDNA分子的体外包装系统 （3）λ噬菌体载体的类型 插入型 置换型 2、M13噬菌体载体 （1）生物学特性 M13是单链丝状噬菌体单链环状DNA分子， 大小为6.4kb,其中含有一个507bp的基因间隔区(IS)g该区间含有复制起始点，是人工构建载体的重点区域。 （2）M13增殖过程