分子生物学实验方案初稿.docVIP

室内培养蚤状溞的简易方法 1. 所用试剂 磷酸氢二钾，磷酸二氢钾 2. 装置与材料 70～100 L 的水族箱2个， 40 W 的日光型水族灯或日光灯1 个，金鱼充气泵1 个，水族箱恒温加热器1个，每平方厘米100～140 目的小水网1个（自制或到水族商店购买）；馒头或动物肝脏，绿藻液数升。 3. 培养方法 水族箱( 50～100 L) 置于靠北室内，防止阳光直射，以免水温昼夜变化过大。注满自来水，箱上方安装水族灯或日光灯，接上充气泵，通电。每个水簇箱投入磷酸氢二钾10～20 g（视自来水的pH 值而定，如果自来水的pH 值低于7，用磷酸氢二钾调节水的pH值，如果自来水pH值是7，用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾共同调节水的pH 值）调节水的pH 值至7～7. 5，移入单细胞绿藻液（废弃的草履虫培养液近窗静置一段时间，待水色变绿时即可）。24 h照明和充气，至7～10 d，待水色呈淡绿色时，把蛋黄大小的馒头弄成十几小块撒入水中，或投入3～4 片鸡肝或一小片猪肝，次日移入蚤状溞，停止充气。水温16～20 ℃，冬天，把加热器定温在14～16 ℃，夏天把水簇箱置于阴凉处（水温28 ℃以上不利于水蚤生长）。2 周左右水中会出现许多水蚤。用小水网捞取一些大小蚤喂水螅后，再投入一些碎馒头。以后水蚤多时，可以每天捞取一些水蚤喂水螅。水蚤少时，隔日捞取一些水蚤喂水螅。每周投入一些碎馒头。另一个水簇箱注满水，加入磷酸氢二钾和绿藻液，一直照明和通电，每隔10 d添加一些有机肥料，直到水色很绿时为止，待前一个水簇箱中水体变质时再移入少量水蚤，并投入一些馒头即可。 4. 常年培养过程中的动态调节 4. 1馒头或肝脏的投放 时间依据水色和水中条件而定；水色较清，看不到馒头碎块，且水蚤密度较高，应及时投放适量馒头块或肝脏；如果水中有明显的馒头块或水质较浑浊，不需投放馒头或肝脏。如果水质已经很浑浊，水蚤都在近水面下游泳，应用网孔大一点的网捞取多余的馒头。 4. 2光照时间 照明用日光型灯管，不可用紫外灯，紫外光有杀菌作用，不利于水蚤生长。开始时昼夜照明，待水色变绿后，白天照明夜晚关灯。如果水色变淡了，继续进行昼夜照明。不可用阳光直射，夏天置于阴凉通风处，或置于地下室，水温控制在25 ℃以下。 4. 3充气时间 水蚤一般喜静水，不可长时间充气，1次充气不要超过1 h，一般情况不需充气。如果气压较低，水蚤浮于水面或水质太清，或刚投入馒头屑，可以充气，以增加溶解氧或起搅拌作用。如果使用老化的气泵，出气量只是新气泵的一半左右，可以长期充气。 4. 4其他动物　 饲养过程中可以投入一些涡虫，水底放置1～3 个瓦片或石片，便于涡虫藏身。水底会出现一些红色的摇蚊幼虫。摇蚊幼虫和涡虫可以清除水底的死蚤。摇蚊幼虫过多时，可以捞取大部分，洗干净后进行速冻保存，待水螅断粮时使用或用来喂鱼。 4. 5施肥　 15 d左右投放5 g 磷酸氢二钾，并补充因蒸发而减少的水分。 4. 6换水　 3～4个月左右或水蚤数量明显下降时，捞取水蚤暂时保种饲养数日，待彻底换水、施肥和加绿藻（方法同前）后，把水蚤移入水簇箱。 4. 7水蚤密度　 水蚤的生命周期只有1周左右，繁殖速度很快，应随时控制其密度。如果水蚤成堆地密集在水面，水体中下层也有许多水蚤，应立即捞除水面的水蚤，可用无水乙醇冷冻保存。这些水蚤在24 h内经产卵后死亡，死水蚤如果没有被摇蚊幼虫和螺类吃完，会很快腐烂分解， 耗尽水体溶解氧，使水体中的所有动物窒息死亡，水体完全被破坏。在这种情况下只有重新开始培养。 实验一 动物基因组DNA提取（以水蚤为材料） 实验目的: 了解并掌握提取动物基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子量质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测技术。 实验原理: 在EDTA和SDS等去污剂存在的条件下，用蛋白酶 K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到动物基因组DNA。 实验仪器: 电泳仪，电泳槽，紫外分光光度计，凝胶成像系统，台式高速冷冻离心机，紫外分析仪。 实验试剂: 无水乙醇，SDS，蛋白酶K，Tris-HCl，EDTA，Tris碱，NaCl，氯仿，异戊醇，琼脂糖，溴化乙啶（10 mg/mL，具致癌作用，用时小心），硼酸，λ-Hind III，点样缓冲液Loading buffer（10×，含0.25%溴酚蓝，40%甘油）。 实验步骤: 1. 取出酒精固定液中保存的样品或新鲜样品，室温中蒸发酒精，新鲜样品用蒸馏水清洗，去除动物表面水分。单个个体（或1~3只）置于1.5 mL微管中，用干净、消毒过的微针挑破动物几丁质外皮。依次加入 500 μL TNE 抽提缓冲液（0.1 mol/L Tris 碱，10 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl，pH 8.0），Tris-HCl 50 μL （pH 8.0,1M