第二章-DNA复制.pptVIP

理论上讲，PCR产物的量以 递增（n为循环次数）。 DNA的化学合成法 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 具体操作过程有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的 化学合成的单元操作 O H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H DMT： 二甲氧基三苯甲基 激活 缩合 氧化 脱取代基 玻璃珠 连接臂 DNA化学合成的用途 合成天然基因 修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等 如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 SNP原理及应用 SNP(全称Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性)，是指在基因组DNA序列中，由于单个核苷酸的变异而引起的多态性。 单核苷酸变异包括转换、颠换、缺失和插入。SNP 在CG序列上出现最为频繁,而且多是C转换为T ,原因是CG中的C 常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。 SNP具有很高的遗传性，成为第三代遗传标记,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等都可能与SNP有关。 SNP原理及应用 用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。 SNP在基因组中分布相当广泛，研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP在基础研究中也发挥了巨大的作用，通过对Y染色体SNP的分析，使得在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。 SNP检测技术 一、基因芯片技术 基因芯片又称DNA芯片(DNA chip )或DNA微阵列(DNA microarray)。其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、数量及序列,从而获得受检样品的遗传信息。其工作原理与经典的核酸分子杂交如Southern和Northern印迹杂交一致,都是应用已知核酸序列与互补的靶序列杂交,根据杂交信号进行定性与定量分析。 SNP检测技术 一、基因芯片技术 SNP检测技术 1、基因芯片制备流程 SNP检测技术 2、基因芯片结果判定 3、基因芯片技术在SNP检测中的应用 根据SNP二态性，合成探针，固定在芯片上，用另一种荧光标记的待测靶序列去杂交。 1）如果靶序列没有SNP位点，探针则能够与靶序列结合，检测到的荧光信号为探针和靶序列荧光信号的重叠，即可推测靶序列； 2）如果靶序列有SNP位点，则荧光信号为探针荧光信号。 3）根据信号强弱和荧光种类检测出被检序列的碱基类别。 SNP二态性：组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记。 SNP检测技术 二、Taqman技术 1、TaqMan探针工作原理 TaqMan探针：设计一小段可以与待测DNA序列中间部位结合的单链DNA（一般50-150bp），在该单链DNA的5′端带有短波长荧光基团（也叫报告基团）,3′端带有长波长荧光基团（也叫猝灭基团）。位于TaqMan探针上的两个荧光基团，由于距离太近，在荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）作用下，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭。具有这种结构特征的探针，就称为TaqMan探针。 2、TaqMan探针的特点 位于TaqMan探针上的两个荧光基团，由于距离太近，在荧光共振能量转移作用下会发生荧光猝灭。利用TaqDNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性，切断探针，可解除猝灭基团对报告基团的猝灭作用，释放报告基团，产生荧光信号。 T A G C C T G C A G A G R Q Reporter Quencher 3、TaqMan探针工作原理 当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，TaqDNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。 3、Ta