[医学]Westernblot.pptVIP

Western blot 实验技术 一、定义： 印迹法（blot）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法（ Southern blot)。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern blot ，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western blot 。 一、定义： 要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。 Western blot 是生物学、生物化学、分子生物学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 Western blot整个过程主要包括：PAGE电泳、转膜及蛋白检测3个阶段。 　 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的原理 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的原理 三、Western Blot 基本原理 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测特定蛋白质的表达情况。 Western blot基本原理 三、Western Blot操作 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 (一)蛋白样品的制备 1.表达靶蛋白的细菌直接用加样缓冲液裂解 2.酵母先用玻璃珠振荡法或酶先裂解细胞，然后制备提取液。 3.哺乳动物组织和细胞可用去污剂温和裂解（注意：一定要加蛋白酶抑制剂，如PMSF等）。 （二）、蛋白样品的定量及准备 凝胶成份 30%丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 ?? 10%SDS 配胶的Tris缓冲液（分离胶与浓缩胶不同） TEMED 过硫酸铵(AP) Tris-甘氨酸电泳缓冲液 凝胶浓度与蛋白分离范围 步骤： 装配好灌胶用的模具。（注意夹紧，防止漏胶） 灌注分离胶（Tris-HCl pH8.9） 在小烧杯内配制分离胶，注意最后加过硫酸胺和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，注意避免产生泡沫（易干扰聚合），操作要迅速。 小心将凝胶溶液用吸管缓慢加入模具内，避免在凝胶内产生气泡。 3）分离胶溶液加至距前玻璃板顶端1.5-2.0cm，轻轻在凝胶上覆盖一层蒸馏水，用于隔绝空气，使凝胶表面变的平整。（还可以用于观察是否漏胶） 4）等待20～30min待凝胶聚合以后，在分离胶和水层之间出现一个清晰的界面，可微微倾斜模具检测凝胶是否聚合。 3.灌注浓缩胶： （Tris-HCl pH6.7） (5%) 1）倒去分离胶上的水并用吸水纸吸净残留的水。 2）配制浓缩胶，轻轻搅拌使其混匀。用吸管将凝胶轻轻加入分离胶上面，直至凝胶达到前玻璃板顶端。 3）将梳子插入凝胶内，直至梳子顶部与前玻璃板平齐。必须确保梳子末端没有气泡，将梳子稍微倾斜插入，可以避免气泡的产生。 4）约20-30min浓缩胶聚合。 5）将玻璃板前后翻转放入电泳装置内，夹紧，如果制一块胶，对侧要放夹板。将电泳缓冲液加入内外槽中，使凝胶上下端均能浸泡在缓冲液中，小心垂直向上拔出梳子，不要将加样孔撕裂，在每孔中加水去除气泡。 检查加样孔是否有气泡及破坏；黏附在凝胶底部的气泡必须出去，以保证电流的畅通。 4. 上样：用微量注射器将样品小心加入样品孔内，避免带入气泡。（加样量尽量一致，将蛋白MARK加入最外侧的样品孔。） 5.电泳： 将电泳插头与相应的电极相接。电流从阴极向阳极。 电泳条件：分离胶：恒压50-80V，进入浓缩胶（蛋白质压成一细线）：恒压100-150V （根据蛋白大小不同选择不同电压和时间，各实验室有成熟的条件）. 当溴酚蓝跑到胶板底部，关闭电源，取出凝胶玻板，轻轻撬开玻板，根据待检测的蛋白切胶。 注意： 每孔上样最低蛋白质量0.1μg,最大20～50μg。 Protein Marker 建议使用预染的蛋白Marker,这样有助于在电泳过程中观测蛋白所在的位置，并且在转膜后通过观察预染蛋白Marker转膜的效果来判断蛋白的转印情况，避免丽春红染色； 为避免边缘效应，在未加样的样品孔中加入等量的样品缓冲液。 上样之前如果没有对样本煮沸，就会出现蛋白质条带拖尾的现象。拖尾是因为蛋白质浓度过高产生的沉淀所致。 样品煮沸后可以在－20℃保存数天，但反复冻融会使蛋白质降解，建议小量分装保存在－70℃ 。 上样时避免样品溢出。 （四）转　膜 Weste