大肠杆菌菌株.PPT

* * 实验十　大肠杆菌（E.coil）梯度转移基因定位（非中断杂交） （一） 一、目的： 熟悉细菌接合和基因定位分析的原理； 掌握大肠杆菌非中断杂交分析的技术； 理解、区分中断杂交和非中断杂交分析的关键技术点。 二、内容： 母液配制，培养基培制，器具干热、湿热灭菌。 活化菌种，接种，扩菌，杂交，涂平板，培养，点种A，点种B-G。 实验结果观察统计分析，基因位点距离计算。 二、实验原理： F因子： DNA小环，占染色体DNA的2% 。 大肠杆菌菌株： 1）F - 菌株 2） F + 菌株 3）高频重组菌株（Hfr） “雄性” “雌性” 原点 致育基因区 配对区 复制区 ? Hfr菌株×F-菌株： Hfr染色体从原点断裂，染色体向Fˉ菌株起始转移。 杂交时间： 全部染色体进入Fˉ需要100min。 F-菌株 × F+菌株 F+菌株 F-菌株 × Hfr菌株 F-不同类型的重组子菌株 杂交： 随机中断：各种条件影响→转移随机中断。 完整染色体进入Fˉ细菌的机会很少，完整的F因子转移机会也很低。导致： 1）Hfr菌株与F-菌株的杂交一般不会使Fˉ变成Hfr 或F+ 。 2）Hfr染色体上的基因呈梯度转移: a b a c b a d c b a 非中断杂交（interrupted matting）基因定位： 自然中断 重组的百分率为指标 中断杂交（non-interrupted matting）基因定位： 人为中断接合 供体基因在受体中的出现时间为指标 后者比前者操作复杂 两种方法测定两个紧密连锁基因时精度较差（以传 统重组作图更好）。 杂交基因定位 三、实验材料： Hfr品系：CSH60 Strs，其余性状为野生型（供体） F-品系：CSH57 Strr ，多重生化缺陷型： （met、lue、 trp、his、ade or pur、arg、lac、gal） （受体） Fˉ接受Hfr不同长度染色体→重组→各种重组子 杂交 CSH57 Strr ，多重生化缺陷型 不能合成 met、lue、 trp、his、ade or pur、arg 不能利用 lac、gal F-品系（受体） ： 如何选出各种重组子，排除供（父）、受（本）体？ 选择性标记(selected marker)基因： 目的：选择出全部的重组子，排除杂交中的受体菌。 措施：培养基中不加Met和Leu。 选什么样的基因？ 反选择性标记(nonselected marker)基因： 目的：排除供体菌，同时保证全部的重组子存活。 选什么样的基因？ 措施：在培养基中添加链霉素(Str)。 Met和离Leu离原点最近 Str离原点最远，使Hfr染色体更多机会进入受体 本实验所配制的选择培养基： A培养基： 排除供、受体 选择全部重组子 B~G培养基： 选择各种重组子 求出重组频率 确定基因连锁情况 各种选择性培养基 添加物质 碳源 10×A 琼脂粉 水 MgSO4 硫胺素(盐酸噻胺，VB1) 精氨酸 腺嘌呤 色氨酸 组氨酸 链霉素 A 　 B　 C D E 　 F G ←--　 -- 葡萄糖 　--------------→ 乳糖 半乳糖 ＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋ ＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋ ＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋ ＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋ ＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋ ＋　　 　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋ ＋　　＋　　 　　＋　　＋　　＋　　＋ ＋　　＋　　＋　　 　　＋　　＋　　＋ ＋　　＋　　＋　　＋　　 　　＋　　＋ ＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋　　＋ 四、方法步骤： 重组子数目取决于接合细胞数，通常Hfr与Fˉ细胞数之比为1:10~20 。 重组子