[工程科技]细胞培养基础.pptVIP

细胞培养基本技术概述 细胞的原代培养 原代细胞培养原理 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例） 取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污 原代细胞培养操作 切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清（或离心，800－1000转／分，5分钟） 原代细胞培养操作 组织块培养法： 用吸管吸取小块，在培养瓶底部均匀摆开，翻转培养瓶，加入2－3ml培养液，培养4－5h后，待组织卡能牢固贴于瓶壁，再轻轻翻转培养瓶，静置培养 3天后观察，在组织块边缘是否有细胞长出，根据培养液颜色，适当补充或更换培养液，10－15d可长成单层，此时，可传代培养。 原代细胞培养操作 消化法： 加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），组织块变松散，颜色略白时，拿出反复吹打，加入培养液终止消化。过滤。 离心，吸去上清，（可反复一次），沉淀加入3－5～10ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，计数，细胞浓度为5×105, 移入培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养 血细胞记数板 血细胞计数板的构造 细胞计数区： 四个角得大方格 16个中格（4＊4） 公式 （细胞悬液的细胞数）/ml＝?（?四个大格子细胞数/4)?×稀释倍数×104? 说明： ?公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3? 消化培养法的主要过程 原代细胞培养结果 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长 如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层 传代细胞培养原理 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次 （一）潜伏期（Latent phase）： 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。 二倍体细胞该期时间长（24-96h） 连续细胞系时间短（10-30min） （二）指数生长期： 细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。 体外培养细胞分裂指数介于0.1-0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。 指数生长期是细胞活力最好的时期，可对细胞进行各种实验 指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则无接触抑制现象。 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制 （三）停滞期： 即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。 在此时应及时进行传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。 细胞的传代培养操作 1、悬浮细胞 可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代 2、贴壁细胞（重点） 贴壁细胞传代培养过程 1、实验准备：细胞培养用的器材灭菌、超净工作台准备、实际预温、操作人员准备。 2、倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。 3、加入2滴管0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。 4、加入1～2滴管含有血清的培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。 5、以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培养箱培养。 6、观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。 注意事