霍山石斛细胞悬浮培养.pptVIP

霍山石斛细胞悬浮培养及条件优化 目的要求 利用细胞悬浮培养技术生产霍山石斛单细胞，解决石斛药用植物资源短缺问题。 方法 以霍山石斛叶片等外植体为实验材料，通过不同的制备方法获得霍山石斛单细胞，研究霍山石斛细胞培养的多种影响因素，应用正交设计优化霍山石斛细胞悬浮培养的条件。 近年来，国内外对药用植物石斛进行了大量深层次的开发，对石斛的需求量也越来越大，而多年来石斛主要靠采收野生资源供药用和出口，由于野生石斛繁殖很慢，自然更新能力很差，加之生态环境的制约，人为过度采掘，致使野生资源日渐枯竭。 其中霍山石斛Dendrobium huoshanense C. Z. Tanget S. J Che 等名贵品种已成为日益稀少的濒危植物，被国家列为重点保护的药材品种。 应用种子离体萌发诱导原球茎或原球茎悬浮培养方式 培养霍山石斛 本实验应用霍山石斛为起始培养材料，以其茎尖和茎段为外植体，通过酶法和机械法获取单细胞，并进行大量培养。该培养方法可明显缩短霍山石斛生长繁殖周期，更宜于后期的有效成分提取等工业生产步骤，对解决石斛资源短缺问题具有重大意义。 1、材料与方法 1.1 材料与试剂 1.2 实验方法 1.1 材料与试剂 液体培养基为改良的MS； 碳源：蔗糖、葡萄糖； 氮源：NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、脲； 植物生长调节剂：IAA、6-BA 1.2 实验方法 1.2.1 外植体灭菌 1.2.2 霍山石斛单细胞的制备 1.2.3 培养基的选择 1.2.4 接种与培养 1.2.1 外植体灭菌 取霍山石斛幼茎段冲洗干净，70%酒精浸1 min 后无菌水冲洗5 次，转入0.1%HgCl2 加1 滴聚山梨酯80 消毒10min 后，无菌水冲洗5 次，用无菌纱布或无菌滤纸吸干水后待用。 1.2.2 霍山石斛单细胞的制备 取霍山石斛灭菌后的外植体，采用组织匀浆机匀浆（或酶解法或玻璃珠捣碎法），滤过，离心，获得霍山石斛单细胞悬浮液。 1.2.3 培养基的选择 以 MS 为基本培养基，pH5.0～6.0； 6-BA/IAA 的配比分别为：2.0︰0.4、1.0︰0.4、0.5︰0.4、1.0︰0.2 和1.0︰0.（mg/L）；添加物为香蕉泥。 1.2.4 接种与培养 用移液器移取3 mL 霍山石斛单细胞悬浮液注入各个培养瓶内，同时用超滤器向每瓶内各滴入不同质量浓度的IAA 和6-BA 组合，将已接种的三角瓶置于（25±2）℃，180 r/min 的恒温摇床中进行黑暗培养 2、 结果 2.1 不同提取方法对获取霍山石斛单细胞的影响 2.2 碳源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.3 氮源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.4 pH 对霍山石斛细胞培养的影响 2.5 培养时间对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.6 不同激素配比对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 2.7 培养温度对石斛细胞悬浮培养的影响 2.8 正交试验的设计与结果 2.9 石斛细胞传代培养 2.1 不同提取方法对获取霍山石斛单细胞的影响 本实验获取霍山石斛单细胞主要用了3 种方法：机械匀浆组织破碎提取法、酶解法、玻璃珠捣碎法。 3 种方法得到的细胞数分别为：7.73×105、1.19×106、1.54×106 个/mL，说明玻璃珠捣碎法效果最好，本实验的操作均采用玻璃珠捣碎法。 2.2 碳源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 分别选用蔗糖和葡萄糖作为碳源对霍山石斛细胞进行悬浮培养，实验结果表明，蔗糖培养的石斛细胞数目为1.13×106 个/mL，葡萄糖培养的石斛细胞数目为6.93×105 个/mL。蔗糖比葡萄糖更适宜石斛细胞的培养，故用蔗糖作为碳源；同时又用不同质量浓度蔗糖对霍山石斛细胞培养，结果如图1 所示。 图1 蔗糖浓度对石斛细胞悬浮培养的影响 2.3 氮源对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 实验选用了 4 种不同氮源对霍山石斛细胞进行悬浮培养，结果见图2。 图 2 氮源对石斛细胞悬浮培养的影响 2.4 pH 对霍山石斛细胞培养的影响 培养基的 pH 值与细胞的生长繁殖关系密切，在培养过程中过酸或过碱可导致细胞死亡，这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。植物细胞培养的pH 一般控制在微酸性的范围内，即pH为5.0～6.0本实验考察不同pH 对霍山石斛细胞数目的影响，结果如图3 所示。 图 3 pH 值对石斛单细胞培养的影响 2.5 培养时间对霍山石斛细胞悬浮培养的影响 霍山石斛细胞在营养充足的情况下，开始快速地有丝分裂，细胞的