毛细管电泳毛细管电泳主要是利用外加高电压下分析物在缓冲.PDF

一、 毛細管電泳 毛細管電泳主要是利用外加高電壓下，分析物在緩衝溶液中解離成不 同帶電性質的型式，藉由不同帶電性質在電場中受吸引或排斥的力量產生 遷移速率的差異，而造成分離的現象。電泳技術的發展始於 1897 年 Kohlrausch 提出在溶液中荷電離子的遷移方程式，解釋荷電粒子在電場作 用下的移動行為，至 1937 年 Tiselius 率先發展出電泳分離技術，成功地分 離人體血清中的 α 、β 、γ 球蛋白及胺基酸，由此 Tiselius也於 1948 年獲 得了諾貝爾化學獎。由於電泳的分離效率與外加電場的大小成正比，電場 越大，分離效率越高，但伴隨著電場作用，在高電壓下分離溶液所形成導 體通路,會因電流的輸送產生大量的焦爾熱,焦爾熱與電流通量成正比，焦 爾熱散熱所形成的熱對流會加速分析物分子質傳擴散 (diffusion) ，且熱效 應降低緩衝溶液黏度，樣品區帶變寬，不利分離，焦爾熱效應限制了傳統 電泳分離時高電壓的使用。自由溶液所產生的熱擴散及對流問題會造成譜 帶變寬和分離效果不佳，因此 Tiselius 藉由流動性較差的凝膠介質如：聚 丙烯醯胺(acrylamide)或瓊脂 (agarose) 來降低熱對流，經由 Tiselius改良 的平板凝膠電泳已被廣為應用在生化分析上，但其具有製備繁瑣與散熱差 的缺點。 電泳技術發展之後， 1974 年， Virtanen 使用內徑 200~500µm的玻璃 毛細管來進行電泳分離； Mikkers 等人使用內徑 200µm的聚四氟乙烯毛 細管，有效地利用小內徑毛細管管壁薄，相對於平板電泳比表面積增大許 多來克服焦爾熱所引起的困擾，改善分離效果。 1981 年 Jorgenson 和 Lukacs 更進一步的證實毛細管電泳為一種具發展性的分離技術，他們利 用 75 µm 內徑的毛細管玻璃管柱，使焦爾熱效應減少到最低，成功地分 離胺基酸衍生物，並且利用螢光偵測器降低方法之偵測極限[1][2] 。 Jorgenson和 Lukacs所利用的毛細管電泳技術後來又被稱毛細管區帶 電泳 (Capillary zone electrophoresis, CZE) ，在此毛細管區帶電泳僅對帶電 物質就進行分離，不帶電荷的中性物質並不適用，直到 1984 年，Terabe[2] 1018 提出了微胞電動力學毛細管層析法 (Micellar Electrokinetic Capillary 1 Chromatography, MEKC) ，於緩衝溶液中加入界面活性劑，在臨界微胞濃 度以上的界面活性劑產生微胞形成假靜相 (pseudo-stationary phase) ，微胞 內部為疏水性，外部為親水性，利用分析物間的疏水性強弱差異，造成分 析物於微胞中的分配比例(partition) 不同，使遷移速度不同，此方法不僅 可用來分離中性物質，也改善了毛細管區帶電泳只能分離帶電分析物的限 制，因而增大了毛細管電泳的應用範圍。 1.1 分離原理 在此我們藉由帶電粒子在毛細管內的電泳遷移行為與影響毛細管電 泳遷移的主要因素電滲流來介紹毛細管電泳的分離原理。 1.1.1 帶電粒子的電泳遷移行為 [1][5] 帶電粒子在自由溶液中，受外加電場作用下，其遷移行為遵守歐姆定律： V = I R (1-1) 其中 V 為外加電場電位差(V) ，I 為電流(A) ，R 為電阻( Ω ) 此時我們微觀地看帶電粒子在自由溶液中的電泳遷移行為，當一個帶 zi 電荷的粒子，在均勻電場 E作用下所受到的靜電作用力 F ｅ F ｅ = z e E (1-2) i o