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植物学专业优秀论文 滑桃树内生菌宏基因组文库的构建与maytansinoids生物合成基因簇的筛选 关键词：滑桃树 基因组文库 植物内生菌 生物合成 原位杂交 摘要：本论文以“高等植物中的maytansinoids Ⅰ型聚酮骨架是由植物内生菌产生的”这一合理假说为前提，以大戟科滑桃树属植物Trewia nudiflora L．为实验材料，尝试通过不依赖于纯培养的宏基因组学(imetagenomics)研究方法，构建滑桃树茎皮内生菌的宏基因组文库，并从该文库中直接筛选获得滑桃树中maytansinoids的生物合成基因簇，进一步鉴定其功能，为高等植物maytansinoids的微生物起源提供直接的证据。 植物内生菌宏基因组研究包括内生菌的富集，宏基因组DNA的提取，文库的构建与评价，文库的筛选四个主要步骤。 内生菌的富集是整个工作的基础。植物内生菌分布于植物组织细胞间隙或内部，基因组与生物量相对植物来说非常微小，这给植物内生菌的富集带来了很大困难，这可能是植物内生菌宏基因组研究至今未能广泛开展的主要原因。通过不断地摸索与尝试，我们建立了一套行之有效的滑桃树茎皮内生菌富集方法，包括机械匀浆、低浓度SDS/NaCl选择性沉淀与裂解和差速离心等。该方法可以一次性处理大量植物材料，快速简便地富集植物内生菌，通过扫描电镜观察与基于16S rDNA的富集效果检测，表明该方法得到的富集样品无明显的植物细胞器残留，内生菌多样性丰富，符合构建内生菌宏基因组文库的要求。 用上述方法，对1.6公斤滑桃树茎皮材料进行内生菌的富集，用无色肽酶和溶菌酶对富集沉淀预处理，用蛋白酶K法提取DNA，所得DNA用UNIQ-10柱纯化、浓缩，得“metagenomic DNA”。16S rDNA的ARDRA分析与测序结果表明：“metagenomic DNA”中绝大多数为微生物来源，在187个16S rDNA克隆中只有4个来源于滑桃树叶绿体，其余则来源于．Actinobactcria，Proteobacteria，Gemmatimonadetes,Firmicutes,Bacteroidetes,Deinococcus-Thermus,Planctomycetes等多个门的微生物，其中Actinobactcria和Protcobacteria门的微生物种类最丰富，总共约占80％。 用“metagenomic DNA”构建了CopyControl Fosmid宏基因组文库，文库约含1.37×10amp;lt;amp;#39;6amp;gt;个包装颗粒，平均插入片段大小约为34.5kb。通过对约200个随机Fosmid的末端测序来评价文库质量，结果表明约88.8％的文库插入片段来源于原核生物，1.6％的插入片段来源于真核生物，其余9.6％的插入片段来源无法判断。 用地高辛标记的AHBA(3-氨基-5-羟基苯甲酸，maytansinoids生物合成起始单元)合酶基因为探针对文库进行杂交筛选，从约75000个文库克隆中得到一个阳性克隆509D8，随后的PCR检测表明该克隆同时含有Ⅰ型PKS基因、AHBA合成酶基因，对这个fosmid插入片段的shotgun全测序和序列分析表明整个插入片段长约34.9kb，含有22个完整的ORF和一个部分的ORF，包含了3个PIgS基因、7个AHBA合成相关基因、一个负责大环内酰胺键形成的酰胺合酶以及一个可能催化C-C键形成滑桃树maytansinoids特有的第二个大环的基因，说明该克隆具有合成滑桃树maytansinoids的潜力，进一步的表达与功能鉴定工作目前正在进行中。应用多种简并引物对文库的PCR筛选结果表明，文库中具有很多PKS基因、卤代酶基因和萜类合成相关基因，表明植物内生菌可能是聚酮类化合物、萜类和其它多种天然产物的潜在来源。 通过不依赖于纯培养的方法构建了植物内生菌宏基因组文库并筛选得到了一个部分的生物合成基因簇，极有可能是maytaminoids生物合成基因簇的一部分。本研究证明了宏基因组学方法在植物内生菌研究中的可行性，是对植物中广泛存在的未培养微生物进行研究的有益尝试，并初步显示了植物内生菌在基因资源和天然产物资源发现方面的巨大潜力。 论文最后一章是天麻抗真菌蛋白(Gastrodianin)基因的mRNA原位杂交分析，通过地高辛标记的mRNA探针，对乌天麻不同组织进行非放射性mRNA原位杂交。结果表明，Gastrodianin在天麻次生球茎中的表达呈现明显的外周表达模式，可能是天麻在地下抵御蜜环菌入侵球茎皮层内部的防卫机制之一。Gastrodianin在地上部分具有很强的转录信号，表达量明显高于地下的球茎，提示除了抗蜜环菌的功能外，Gastrodianin可能具有其它的生理功能。 正文内