一株新型饲料用酶菌株的筛选及发酵条件研究教案.doc

一株新型饲料用酶菌株的筛选及发酵条件研究 ? ????植酸酶(phytase)也称肌醇六磷酸酶(myo - inositol-hexaphoshate phosphohydrotase)，它是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷酸（或者磷酸盐）一类酶的总称…，分为两类，一是3一植酸酶(EC 3.1.3.8)，二是6一植酸酶(EC 3.1.2.6)，是一种新型、绿色环保的饲料用酶。由于动物的消化道不能吸收植酸酶，大量未被利用的植酸磷排入环境，造成水域的富营养化污染。植酸酶可释放植酸中的磷，提高动物对磷的吸收利用率，减少排泄物中有机磷的含量。目前，对酸性植酸酶研究较多，它仅适用于单胃动物畜禽和少数鱼类（如虹鳟等），但不适于消化道为中性的鲤科鱼类，因此对中性植酸酶缺乏较深入的研究。鉴于此，我们从土壤中筛选出产中性植酸酶的高产菌株，对其菌株的培养和分泌中性植酸酶的条件进行了初步研究，为扩大中性植酸酶在饲料工业中的应用提供理论依据。 1??材料与方法 1.1??材料与试剂 ????植酸酶菌株分离样品：样品为将采集于威海郊区玉米地肥沃土壤中的植酸酶菌珠与麸皮、发芽小麦混匀并放置20余天后的混合物。 ????试剂：植酸钠p - 0109（Sigma公司），植酸钙（湖北三鑫生物工程有限公司），其他试剂均为国产分析纯。细菌营养肉汁平板培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、NaC15g/L、琼脂15--20 g/L,pH 7.0。 ????植酸钙筛选平板培养基：葡萄糖20g/L、CaC122g/L、NHaN035g/L、KC10.5g/L、MgS047H200.05g/L、Fe-S047H200.01g/L、MnS04 H200．叭g/L、植酸钙lg/L、琼脂15g/L，pH 7.0。 ????产酶培养基：可溶性淀粉40g/L、胰蛋白胨10g/L、NAN028.6g/L、NHaN035.0g/L、K2HP040.10g/L、KC10.10g/L、MgC120.10g/L、MnC120.09g/L, pH 7.0. 1.2方法 ????产中性植酸酶菌株的筛选：将土壤样品稀释后均匀涂布到筛选的培养基培养，3--4d后将产生透明圈的菌株接种于营养肉汁平板培养基，划线分离；挑选单菌落接种于筛选的培养基培养，3--4d后测量直径比（直径比=透明圈直径／菌落直径）；选择直径比大的单菌落，编号后接入斜面种子培养基保存。 ????挑取上述初筛菌株接种于细菌营养肉汁培养基，30℃、120--150r/min摇振培养24h后，按10%接种量接种于100mL的产酶培养基，30℃、150r/min摇振培养5d，每24h取5mL培养液，3000r/min离心去菌体，上清液利用截留分子量为I0000U的透析袋在去离子水中透析3--4h，得到去除无机磷的酶液用于酶活性测定，根据酶活力大小对菌株进行复筛。 ????培养条件对产酶的影响：分别采用不同的发酵温度、接种量、培养基初始pH和装液量，经培养后测定发酵液酶活，找出最佳培养条件；更改培养基碳氮组成，以找出最佳碳氮源。 ????酶活测定方法：采用硫酸亚铁一钼蓝法测定酶活l 6]。酶活性单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟释放出1 nmol无机磷所需的酶量为一个酶活性单位，用U表示，单位为nmol/min。 2结果与分析2.1??菌株筛选土样经过筛选培养基涂布、富集培养、多次划线分离、点种筛选，共初筛出21株植酸酶产生菌。然后，再筛选出其中透明圈与菌落直径比值较大的10株（以phy代表植酸酶菌株），在30℃、150r/min振荡下分别进行发酵培养24h，测定其发酵液酶活力大小。结果见表l。由表1可见，所筛选出的10个菌株的透明圈与菌落直径比均在1.9--2.5之间，得到酶活大于100IU/mL的菌株有2株，即菌株phy7和phylO。phyl0经16SrDNA序列测定与分析，得到该菌属于假单胞菌属(Pseudomonas)，且从系统发育树得出该菌归属绿脓假单胞菌． 2.2中性植酸酶产酶发酵条件 ????以phyl0为实验菌株进行产酶条件研究。 ????培养基起始pH对产酶的影响：配制不同起始pH值(4.0—9.0)的液体发酵培养基，30℃、150 r/min、10%的接种量振荡培养24 h后测定其发酵液酶活，结果见图1。从图l可见，pH为4.0--5.0时产酶增长最快，pH为5.0时产酶量最多，pH为6.0之后时产酶量迅速下降，因此确定最佳培养基起始pH为5.0。 ????发酵温度对产酶的影响：在20--40℃发酵温度下，150 r/min振荡培养24h，测定其发酵液酶活，结果见图2。图2表明，发酵温度为30℃时产酶量最高，发酵温度为25℃和35℃时酶活都有所下降，发酵温度为20℃和40℃时产酶量最低，因此最佳发酵温度为30