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miRNA图谱分析的新选择 【字体：大 中 小】　　　　时间：2008年11月26日　　 　　来源：生物通------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------  神秘的microRNA在基因表达调控中扮演着重要的角色。为了鉴定分化表达的miRNA，许多研究都以整体的miRNA表达图谱作为起始。目前进行miRNA图谱分析的主要方法是利用miRNA芯片。但其样品量大，耗时较长。在此，我们介绍一种miRNA图谱分析的新方法，既能准确定量miRNA，样品量又无需那么多。ABI公司通过对分析方法的创新改造，将TaqMan分析和实时定量PCR的特异性、灵敏度和重复性金标准引入到miRNA的检测和定量中。  （生物通专稿）microRNA（miRNA）是一类天然存在的非编码RNA，在基因调控中扮演着重要角色。它们是高度保守的单链RNA（~22个核苷酸），从更长的发夹结构前体转录本中剪切而来。到目前为止已经报道了800多个人类miRNA，还有更多的在等待实验的验证。一系列研究表明miRNA参与了许多细胞内的过程，包括发育、分化、增殖、凋亡等，那么它们自然也与癌症发育息息相关。 为了鉴定分化表达的miRNA，许多研究都以整体的miRNA表达图谱作为起始。目前进行miRNA图谱分析的主要方法之一是利用miRNA芯片，一次实验即可在整体全局角度上同时检测多个miRNA的表达情况和相互关系。 可是，事情并非如此简单。miRNA研在生理功能上如此重要，在过去却一直不为人知的原因，很大程度是由于其分子小，风度低，不稳定，种类多，同源程度高，等等。仅仅22nt左右大小的单链RNA分子，极低的丰度，纯化难度可想而知，特别是在样品量有限的情况下。由于分子小而导致难以扩增，更增加了微量样品的分析困难，特别是高通量对大量样品进行分析----几乎成为Mission Impossible----不可能完成的任务。 锁定miRNA目标的定量分析也好，miRNA芯片也好，对样品量有一定的要求----以芯片为例，通常需要1微克以上的RNA，有的甚至需要10微克。而对于只有几个-到数百个细胞的样品来说，无法扩增的情况下芯片就有些束手无策了。 在此，生物通介绍一种miRNA图谱分析的新方法，既能准确定量miRNA，样品量又无需那么多。ABI的TaqMan MicroRNA Arrays和我们常规说的芯片其实不同，这种芯片更像是TaqMan MicroRNA Assay的芯片集成形式----通过对分析方法的创新改造，将TaqMan分析和实时定量PCR的特异性、灵敏度和重复性金标准引入到miRNA的检测和定量中。 我们首先来看看TaqMan MicroRNA Assay----其实就是RT-qPCR----它利用反转录和定量PCR来定量miRNA的表达。可是，要知道，仅仅22nt的RNA短序列模板可不是一般的反转录可以做到的，其设计的巧妙创新之处在于Megaplex反转录中的引物并非随机引物，而是靶特异的茎环结构的反转录引物。这个创新设计解决了miRNA定量中的基本问题：成熟miRNA的短序列（~22nt）不允许在反转录反应中使用传统的随机引物。茎环结构提供了仅针对成熟miRNA模板的特异性，并形成引物/成熟miRNA嵌合体从miRNA的3’端开始延伸。产生的较长反转录扩增产物能作为模板，用于标准的实时定量PCR分析。就这样，miRNA就可以被扩增了----一旦扩增问题解决，样品量小，低丰度等等问题自然也迎刃而解，miRNA的定量检测和图谱分析也就有迈出了关键的第一步。 道理虽简单，但这也不是你能自己合成的引物。所以只能去ABI购买。Megaplex Primer Pools提供了Sanger MiRBase v10的综合覆盖度，覆盖人、小鼠或大鼠的667、518或303个miRNA。能满足已知miRNA图谱分析的需求。如果你的研究目标恰在其中，那么恭喜，后面的工作就相当顺理成章了。 因为有了扩增，TaqMan MicroRNA Assay就显得更加灵敏。研究人员只需要极少量的总RNA样品即可。DNA预扩增步骤的引进更显著降低了起始RNA样品量。即使1ng的总RNA，也能产生综合的表达图谱（Reference 1)。这样1个细胞也能进行分析，对临床样品而言绝对是个利好消息。而传统的方法至少需要几百纳克总RNA。 对于这种创新的扩增方法，实验表明是可靠的----TaqMan Assay的线性动态范围也很广，你可以得到多达7个对数级的线性动态范围。从几个拷贝到几百