1 纸电泳.docVIP

实验七 纸电泳 一.目的要求 了解电泳的原理和应用；学习纸电泳的操作。 二．实验原理 电泳是指胶体颗粒在电场中的定向移动，只要是带电的颗粒，从小分子的氨基酸、核苷酸，到大分子的蛋白质、病毒，在电场的作用下均可以发生电泳。电泳技术已广泛应用于理论研究及临床诊断。 在一定的pH溶液中，不同物质的带电微粒的带电性和带电量是不同的，如果它们的分子量不同，分子形状也各异，在一定的电场下，它们移动的方向和速度也将不相同，故此可利用电泳作为分离和鉴定这些物质的依据。 纸电泳是利用纸作为支持物，使带电微粒在纸上电泳，从而达到分离的一种方法。将样品点在用缓冲液浸湿的滤纸上，将滤纸放在电泳槽的支架上，滤纸的两端浸在缓冲溶液里，接通电源，纸的两端就有一定的电压，吸引带电颗粒在纸上移动。氨基酸在其等电点时以兼性离子存在，若溶液的pH低于氨基酸的等电点（pH﹤pI），则氨基酸分子带有正电荷（Aa+），电泳时向负极移动；若溶液的pH高于等电点（pH﹥pI），氨基酸分子带有负电荷（Aa-）,电泳时向正极移动。 电泳过程中，由于电极反应会使连接正极和负极的电解液的pH向相反方向变化，所以应用缓冲溶液以保持pH相对稳定。另外，选用挥发性的缓冲溶液较好，因为电泳后滤纸烘干时容易除去，以减少对显色的影响。 三．实验用品 仪器：DY-W2型电泳仪、DC-Ⅱ型电泳槽、镊子、滤纸、直尺、铅笔、毛细管、电吹风机、喷雾器、剪刀。 药品：0.04mol/L甘氨酸、0.04mol/L赖氨酸、甘氨酸与赖氨酸的混合液（体积比1：1）、0.5%茚三酮-乙醇溶液、1mol/L乙酸溶液。 四．实验步骤 1、 点样 取12cm*8cm滤纸一块，用铅笔在滤纸之一端2cm处划以直线为原点线，在原点线上距离均匀的位置点上3个点，分别注上“甘”、“混””赖”3个字,然后再3个点上点样. 2、 准备 本实验使用DY-W2型电泳仪和与其配套的DC-Ⅱ型电泳槽. 向电泳槽内加入1mol/L乙酸溶液,至红水平线位置(中间的槽约210ml,两边的各190ml),可通过底角调平.盖好电泳槽的盖. 检查电泳仪的开关是否在“关”的位置,然后用输出引线把电泳仪和电泳槽的“+”、“_”、极依次连接好. 调整“输出选择”,旋至零位,将选择开关扳到“100mA,600V”的位置. 打开电源开关,指示灯亮,预热10min. 将点好样的滤纸放在电泳槽的电解液中全部浸湿,立即取出放于支架(两槽之间的平台上),纸条的两端要浸在电解液中(点样处千万不能浸入电解液),由于甘氨酸和赖氨酸在1mol/L的乙酸溶液中均带正电荷,所以要把点样的一端浸入连接正极的槽内,盖好电泳槽盖. 电泳过程中会放出热量,电泳槽中有两个空腔利于散热,对热敏感的物质(如酶蛋白)进行电泳时,若环境温度过高,可以通过自来水对支持物或缓冲溶液进行冷却. 3、 电泳 调整“输出选择”,使电压达到400V,电泳10min.如果电泳一段时间后电压下降,应调整电压到400V.在实验过程中应有人观察电压与电流大小,并在相隔2-5分钟内记录电流和电压. 4 、显色 用镊子取出滤纸,用电吹风吹干,喷上茚三酮显色剂润湿滤纸,再用热吹风吹干显出色斑.注意防止显色剂流动,冲洗电泳结果. 5、 记录 用铅笔描出色斑的轮廓,量出色斑(中心浓度最高处)至原点线的距离(cm),将滤纸贴在实验报告上,并将环境温度、电解液、电压、通电时间、显色剂等实验条件同样纪录在报告上。 五．注意事项 1．点样应在滤纸的一端距纸边２－１０cm处。样品可点成圆形或长条形，长条形的分离效果较好。点样量为５－１０微克和５－１０微升。点样方法有干点法和湿点法。湿点法是在点样前即将滤纸用缓冲溶液浸湿，点样时可用吹风机吹干后多次点样，因而可以用较稀的样品。 2．严禁空载，空载易造成电泳仪损坏，只有高级双稳（能控制电流强度和电压）电泳仪才提供空载保护。 3．电泳完毕后，应先关闭电源，再拔小插头，以免触电。在仪器接通电源工作期间，严禁接触电泳槽电极、电极插头和电泳物等，严禁输出电极与地短路，以免破坏仪器。仪器不许空载运行，防止震动，使用环境应保持干燥，应无腐蚀性气体存在。 六．思考题 １、为什么电泳法可以分离氨基酸？ ２、在重复使用电泳仪时，如何控制电泳时的电压和电流？ ３、同时进行多组样品电泳时，如何控制电泳时的电压和电流？ ４、当一个电泳仪同时带动两个电泳槽时，电流表的电流读数与实际电泳的电流数有何关系？ ５、电泳电压高低与电泳时间有何关系？ ６、在本次试验中是采用恒电压电泳或是恒电流电泳？或两者均不是？根据实验纪录的数据分析。