绒山羊表达红色荧光及转胰岛素样生长因子Ⅰ基因体细胞核移植胚胎.PDFVIP

中国科学 C 辑 :生命科学 2008 年 第 38 卷 第 12 期 : 1152 ~ 1159 SCIENCE IN CHINA PRESS 绒山羊表达红色荧光及转胰岛素样生长因子基 因体细胞核移植胚胎的制备 ① ② ① ① ① ① ① ① 郭旭东 , 杨东山 , 奥旭东 , 吴侠 , 李光鹏 , 王玲玲 , 宝明涛 , 雪莲 , 旭日干①* ① 内蒙古大学, 哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室, 呼和浩特 010021; ② 中国科学院, 广州生物医药与健康研究院, 广州 510663 * 联系人, E-mail: xurg@ 收稿日期: 2008-04-11; 接受日期: 2008-06-27 国家高技术研究发展计划(批准号: 2002 AA242061)、内蒙古自治区自然科学基金(批准号: 200607010405)、内蒙古自治区高等学校科学研 究项目(批准号: NJ06055)资助 r 关键词 摘要 利用含有红色荧光和Neo 基因双选择标记的IGF1 毛囊特异表达载体pCDsR-KI 转染绒山羊胎儿成纤维细胞, 经G418 筛选获得具有红色荧光的IGF1 转基因细胞. 核移 绒山羊 植操作前, 通过比较卵母细胞体外成熟培养不同时间的成熟率以及核与极体的距离, 确 胰岛素样生长因子 定20 h为绒山羊卵母细胞的最佳成熟时间. 比较了不同激活方法和培养体系对孤雌胚激 毛囊 活效率和孤雌胚早期发育的影响, 结果表明: IA23187+6-DMAP组的激活效率和囊胚率 胎儿成纤维细胞 转基因 (88.721.6)均稍高于乙醇+6-DMAP组(86.420.4), 但二组相应数据之间差异均 体细胞核移植 不显著(P0.05), 选择前者作为转基因核移植胚的激活方案; SOFaa和CR1aa 两种体外 培养体系中, 孤雌胚卵裂率(86.8vs83.9) 和囊胚率(23.1vs 17.2) 均差异不显著 (P0.05), 选择结果较好的SOFaa组. 比较了不同电融合参数的融合效果, 结果表明: 190 V/mm处理组结果(62.4)显著高于130 V/mm(32.8)和200 V/mm(42.9)组(P0.05). 通 过T-SCNT获得转基因重构胚胎203 枚, 48 h卵裂率为79.3 (161/203), 第7~9 天囊胚发 育率为15.3 (31/203). 所得到的31 枚囊胚中, 较强表达红色荧光蛋白的囊胚数为17 枚 ( 阳性率为54.8). 随机挑选两枚红色荧光囊胚以PCR法进行鉴定, 结果全部为转基因阳 性. 以上结果显示: (i) 表达载体的红色荧光蛋白和Neor基因可以正常表达可获取转基因 细胞和阳性转基因胚胎; (ii) 所制备转基因囊胚仍有部分不表达红色荧光蛋白, 说明即 使选择转基因阳性细胞进行核移植所得囊胚也并非全部为转基因阳性, 在囊胚期进一步 筛选是必要的; (iii) 通过TSCNT操作及优化, 成功获得了表达红色荧光并同时转有IGF1 基因的绒山羊胚胎, 为绒山羊的转基因研究提供基础数据. 内蒙古白绒山羊( 以下简称绒山羊) 是我国在蒙 地方良种[1]. 绒山羊的毛被主要由髓质发达的粗毛和 古山羊的基础上经过长期选育而形成的绒、肉兼用型 无髓的绒毛两类纤维组成, 与之相应的皮肤毛囊也 1152