试验原理DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同-中国试剂网.PDFVIP

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2018-06-06 发布于天津
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试验原理DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同-中国试剂网

中国试剂网 3.16.4.6 双向电泳的实验过程一、实验原理：2-DE 的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向 SDS是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。二、实验步骤： 1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul 裂解液(1mg 蛋白:100ul 裂解液)振荡器上振荡 10min 左右，共处理一个小时。其中每隔 10～15 分钟振荡一次，然后 13200rpm 离心15min 除杂质，取上清分装，每管70ul，—80o 保存。 2. Bradford 法测蛋白含量取0.001g BSA （牛血清白蛋白）用1ml 超纯水溶解,测定BSA 标准曲线及样品蛋白含量。取7 个10ml 的离心管，首先在5 个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA 溶解液，另2 管中分别加入2 ul 的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul ），然后，各管中分别加入4ml 的Bradford 液（原来配好的Bradford 液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀， 2min 在595nm 下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA 的OD 值，再测样品 OD 值。(测量过程要在一个小时内完成) 。例如：编号蛋白量（ul ） Buffer(ul) Bradford(ml) OD595 值 1 0 80 4 0 2 5 75 4 0.024 3 10 70 4 0.061 4 15 65 4 0.091 5 20 60 4 0.116 Bt4 2 78 4 0.079 Bt4 4 76 4 转Bt4 2 78 4 0.075 转Bt4 4 76 4 中国试剂网 3.16.4.6 标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y 为 OD 值，X 为蛋白含量。 a 、b 通过作图输入数据可知相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得 OD 值测量过程：比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD 值。 3. 双向电泳第一向IEF （双向电泳中一律使用超纯水） 3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT ，用700ul 水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul （0.5%v