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实时定量PCR（qRT-PCR） Polymerase Chain Reaction（PCR）　聚合酶链式反应 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR基本原理 （1）模板 1、单、双链DNA，cDNA均可 2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂DNA结合蛋白类 3、一般100ng DNA模板/100?L,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 （3）Taq DNA聚合酶 1、酶的用量一般为0.5-2.5 U/50 ?l， 2、酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 循环参数 变性 使双链DNA解链为单链,94℃ 30-40s 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 循环参数 （3）延伸 68-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模板DNA的浓度,一般为25-35次 次数过多,扩增效率降低,错误掺入率增加 常用PCR反应体系 (以HiFi Taq为例) 模板