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过程原理研究的例子 阿维菌素形态与搅拌 过程优化后的参数趋势曲线 补料操作优化 发酵过程中pH基本没有变化，OUR、CER也基本没有变化，但是阿维菌素的合成速率提高，最终5050 μg/ml，比对照罐批提高了30%。 排气乙醇含量与测定 ━ EER … OUR┄ CER ― RQ × 总糖 △ 还原糖 过度补料造成巨大EER（乙醇释放率）峰值，pH快速下降，阿维菌素产物严重下降 阿维链霉菌发酵过程差异蛋白质组学分析 二维电泳蛋白谱 avermitilis 出发菌株和工业突变株细胞在不同培养基培养过程全蛋白图谱 A：出发菌株（左）与工业菌株（右）TSB培养基培养52h； B：工业菌株TSB培养基培养52h（左）和在复合培养基培养52h（右） 建立匹配组和比较组 其中“△”为Landmarker，“□” 和“□” 为手动匹配蛋白点，其余字母代表自动匹配蛋白点 在对应的2-DE凝胶上进行切点、酶解、MS/MS鉴定。根据肽指纹图谱（PMF）信息，通过NCBI数据库进行搜索，共有132种蛋白被成功匹配 蛋白点1804（NP_828150）的肽指纹图谱 蛋白点1804（NP_828150）的一级与二级MS肽指纹图谱 132种蛋白中，按功能进行分类 主要参与: 碳水化合物运输和代谢、 氨基酸的运输和代谢、 核苷酸的运输和代谢、 能量产生和转换、 次级代谢物的合成与调控以及信号转导等过程。 碳水化合物运输和代谢为例差异蛋白质分析 S. avermitilis 在TSB（左）和复合培养基（右）中差异表达蛋白点（碳代谢）。“○”代表复合培养基上调蛋白点；“□”代表复合培养基中下调蛋白点 碳水化合物运输和代谢相关蛋白的表达情况 碳水化合物运输和代谢相关蛋白的表达情况(续） 结果 糖酵解途径（EMP）酶包括由gap编码的3－磷酸甘油醛脱氢酶（3515、2305）、fba编码的二磷酸果糖醛缩酶（4305）、gpm编码的磷酸甘油酸变位酶（9304）等在复合培养基的对数生长末期都有高表达。 此外，与碳水化合物的运输和代谢有关的另一些酶类表达量也明显提高。包括iolE1编码的IolE蛋白（3409），amyA2编码的α淀粉酶（7808），galE4和galE5编码的UDP-葡萄糖 4-差向异构酶（8519，8522），nagB编码的6－磷酸葡萄糖胺脱氨基酶（3308）。 α淀粉酶的高表达与复合培养基组分特异相关，菌体必须不断合成和分泌淀粉水解酶生成葡萄糖才能维持菌体生长和代谢。而gal和nag的高表达说明了S.avermitilis在工业复合培养基中对数生长期末期，由于易利用碳源葡萄糖成为限制性基质，碳代谢发生了迁移，半乳糖、氨基糖等碳源通过这些酶可转变为葡萄糖，进入糖酵解途径。而糖酵解途径酶的高表达则说明了次级代谢物阿维菌素合成仍需要葡萄糖代谢。 结果（续） 与糖酵解途径不同，S. avermitilis工业菌株在复合培养基中几乎所有鉴定出的参与TCA途径的酶都是低表达。而相对于复合培养基而言，TSB培养物中次级代谢物合成并没有启动。复合培养物中TCA途径酶的明显低表达，表明了此时代谢流的迁移，大量碳水化合物代谢中间体流向次级代谢途径而非完全氧化。这也体现了发酵过程中降低能荷，使代谢流向次级代谢迁移的调控思路。 宏观与微观代谢研究的相关性 S. avermitilis工业菌株在复合培养基： OUR、CER、pH、补糖操作的实验结果 碳水化合物运输和代谢的差异蛋白质分析 糖酵解途径（EMP）对数生长末期都有高表达， 易利用碳源葡萄糖成为限制性基质时，淀粉水解、半乳糖、氨基糖等碳源通过这些酶可转变为葡萄糖 参与TCA途径的酶都是低表达 大量碳水化合物代谢中间体流向次级代谢途径而非完全氧化，次级代谢物阿维菌素合成仍需要葡萄糖代谢 30小时耗氧率OUR下降。这也体现了发酵过程中降低能荷，使代谢流向次级代谢迁移的调控思路。这时阿维菌素开始形成，这与表现出较高的协迫蛋白表达是一致的。也说明次级代谢物合成的启动， 发现阿维链霉菌中的adhA基因产物ADH蛋白（醇脱氢酶）高表达 S.avermitilis在复合培养基发酵对数生长末期时的adhA基因的高表达(2513.4513,6623) S.avermitilis在复合培养基发酵时产生乙醇的微观研究 对数生长末期葡萄糖成为限制性基质从而诱导adhA高表达 供氧不足造成对数生长末期一定的氧限制，即氧化磷酸化水平较低时此时一部分丙酮酸盐通过丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶ADH的作用生成乙醇 在ADHs的作用下，乙醇可以进入中心代谢途径为细胞生长提供碳源和能源 乙醇的生成也可作为判定阿维菌素发酵过程中代谢流迁移的一个重要参数 产生乙醇的宏观代谢流分析与应用 碳代谢