[农学]第11章 细胞破碎.ppt

本章内容 细菌 破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母 葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架，甘露聚糖形成网状结构，细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度； 霉菌 细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高； 植物细胞 次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。 细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 2.1 破碎程度的评价 破碎程度常用细胞破碎率（%）表示。 破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： Y（%）=[（N0-N）/N0]*100 其中N0——原始细胞数量； N ——经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。 N0和N的确定方法： 直接计数法：通过平板计数技术或血球细胞器上用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。 间接计数法：在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（eg.可溶性蛋白、酶等）。 细胞破碎机理图 温度的影响： 有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450-750kg/m3时，温度由300C提高到500C，破碎率约提高1.5倍。 破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同 大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎 复习思考题 能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 （3）有机溶剂 （4）EDTA螯合剂 处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。 G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。 通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒。 化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难， 并影响最终产物纯度 化学渗透法特点： 缺点 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 优点 5 物理法 渗透压冲击法 冻结-融化法 干燥法 1）渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法， 将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。 渗透压 细胞破碎 2）冻结-融化法 将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能. 另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。 冷冻干燥适用于不稳定的生化物质 3）干燥法 气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥 机械破碎法与非机械破碎法的比较 比较项目 机械法 非机械法 破碎机理 切碎细胞 溶解局部壁膜 碎片大小 碎片细小 细胞碎片较大 内含物释放 全部 部分 黏度 高（核酸多） 低（核酸少） 时间，效率 时间短，效率高 时间长，效率低 设备 需专用设备 不需专用设备 通用性 强 差 经济 成本低 成本高 应用范围 实验室，工业范围 实验室范围 选择破碎方法的依据： 细胞处理量； 细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)； 目标产物对破碎条件的敏感性； 破碎程度； 目标产物的选择性释放 1、微生物细胞破碎的原因是什么？有哪些具体的方法？ 2、G+菌、G—菌以及酵母菌细胞壁的差别在哪里？ 3、请指出珠磨法与高压匀浆法各自的原理及适用范围。 4、细胞破壁应注意哪些问题？ Thank you! * * * 在溶酶系