ercc1的表达纯化及其单克隆抗体的制备.docVIP

ERCC1的表达纯化及其单克隆抗体的制备 作者：李晓杰, 蒋华, 高慧萍, 姚晓, 石必枝 李宗海 【摘要】 目的: 表达纯化ERCC1蛋白并制备其单克隆抗体（mAb）。方法: 克隆并原核表达ERCC1蛋白, 其氨基端带有6His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠, 经融合、 筛选制备特异性mAb。结果: 成功表达了ERCC1蛋白。SDSPAGE显示所表达蛋白的相对分子质量（Mr）约为37 000。获得了1 株稳定分泌抗ERCC1抗体的杂交瘤细胞株（6F8）, 其分泌的mAb的Ig亚类（型）为IgG2b。ELISA检测, 对应腹水mAb的效价为1∶1.5×106。Western blot结果显示抗ERCC1 mAb具有良好的特异性。结论: 成功地表达纯化ERCC1蛋白并制备了1株抗ERCC1 mAb。 【关键词】 ERCC1; 原核表达; 纯化; 单克隆抗体 核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）是哺乳动物细胞DNA 修复的主要途径; 切除修复交叉互补基因（excision repair crosscomplementing 1, ERCC1）在核苷酸切除修复过程中起着关键作用。最近, 很多研究表明它的表达与肺癌、 卵巢癌、 头颈部肿瘤对铂类药物的敏感性有密切关系［1-3］, 其表达有望作为铂类用药的分子标记。但是迄今为止, 国内尚无制备其单克隆抗体(mAb)的报道。我们在本研究中表达纯化了ERCC1蛋白并制备了其mAb, 为将来检测ERCC1奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 pET28a(+)载体、 大肠杆菌BL21（DE3）、 骨髓细胞系Sp2/0、 A431细胞系由本实验室保存。骨髓细胞系Sp2/0以DMEM、 100 mL/L小牛血清, 在37℃、 50 mL/L CO2条件下培养。A431以DMEM、 100 mL/L胎牛血清, 在37℃、 50 mL/L CO2条件下培养。弗氏完全佐剂及不完全佐剂购自Sigma Aldrich。胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。GAPDH抗体购自康成生物技术有限公司。HRP标记的羊抗鼠二抗由本实验室制备。其他试剂均为国产分析纯。BALB/c小鼠由本研究所实验病理室提供。 1.2 方法 1.2.1 载体构建及鉴定 以人胎盘 cDNA为模板, 加入针对ERCC1基因的特异引物进行PCR扩增。上游引物ECF为: 5′GGAATTCCATATGGACCCTGGGAAGGACAAAGAG3′（划线处为Nde Ⅰ 酶切位点）; 下游引物ECR为: 5′CCCAAGCTTTCAGGGTACTTTCAAGAAGGGCTCG3′ （划线处为Hind Ⅲ酶切位点）。以KOD plus DNA 聚合酶（ToYoBo）PCR扩增, 反应的条件为: 94℃ 3 min, 然后进行30个循环: 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 68℃ 50 s, 最后68℃延伸10 min。PCR产物纯化回收, 用NdeⅠ和Hind Ⅲ双酶切, 同时用NdeⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切pET28a(+) 载体质粒, 在T4 DNA连接酶作用下, 构建重组表达载体pET28a(+)ERCC1。 1.2.2 重组ERCC1蛋白的表达及纯化及复性 用pET28a(+)ERCC1转化大肠杆菌BL21(DE3)。挑取单克隆接种于含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中, 37℃震荡培养过夜, 按1∶100转接, 37℃培养至A600约为0.6时, 加入IPTG至终浓度为0.8 mmol/L, 20℃过夜诱导表达。收集菌液, 以10 000 r/min离心10 min, 弃上清, 用含1 mmol/L PMSF和 1 g/L TritonX100的缓冲液A（20 mmol/L TRIS、 pH7.8、 0.5 mol/L NaCl ）重悬细菌沉淀, 经超声破碎细菌后, 以12 000 r/min 离心10 min。分别取上清和沉淀SDSPAGE电泳确定目的蛋白存在于包涵体中, 包涵体经充分洗涤后以缓冲液A（20 mmol/L TRIS、 pH7.8、 0.5 mol/L NaCl、 0.5 mol/L imidazole、 8 mol/L urea） 溶解。溶解上清采用BioRad DuoFlow层析系统, 进行NiNTA HisBind亲和柱层析, 缓冲液B（20 mmol TRIS、 pH7.8、 0.5 mol/L NaCl、 0.5 mol/L imidazole）梯度洗脱。收集洗脱峰, 100 g/L SDSPAGE鉴定纯化效果。将纯化后的蛋白加到透析袋中, 以含尿素浓度逐步下降的复性缓冲液（20