[医学]酶免疫技术.pptVIP

（三）技术要点 1 固相载体： 与Ab或Ag有较高结合容量，结合稳定；可结合AgAb及亲和素或链酶素等大分子蛋白；生物大分子固化后应保持活性，活性基团朝向反应溶液；固相化方法简便快速经济。 塑料：非共价或物理吸附。小试管、小珠、板条 微颗粒：化学耦联，结合容量大，均匀分散在液体中，反应快，可磁化，方便分离。 膜载体：硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、尼龙膜，非共价结合，吸附力强 2 免疫吸附剂 指与固相载体结合的Ag或Ab。将Ag或Ab固相化的过程称包被（coating）。用1-5%牛血清白蛋白或5-20%小牛血清等结合包被后固相载体表面剩余的少量未吸附位点，为封闭（blocking）。 斑点-酶联免疫吸附试验（dot-ELISA ） 原理：似ELISA，但载体为硝酸纤维素（NC）膜。更灵敏、节约、简便，易保存 斑点-酶免疫渗滤试验Immunofiltration Assay，IFA 原理：以NC膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。以胶体金为标记物的金免疫渗滤试验省却了酶对底物的反应，更加简便快速。 以双抗体夹心法HCG为例：标本中HCG与NC膜上抗-HCG结合，再加胶体金标记的抗-HCG抗体，形成双抗体夹心复合物（红色） 原理：滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用向另一端移动，移动过程中待测物与固定于膜上某区域的抗原或抗体结合而被固相化，通过标记物染色。 免疫层析试验Immunochromatography Assay，ICA 免疫印迹技术Immunoblotting Test，IBT 又称蛋白质印迹(Western blotting) 是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） + 蛋白转运 + 酶免疫技术 将含有目标蛋白(抗原)的样品→SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)或非变性电泳(Native)等分离→转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面→将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。 生物素与亲和素系统酶联免疫吸附试验Biotin-Avidin System ELISA（BAS-ELISA） 　　生物素-亲和素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。 多级放大效应-灵敏 生物素与亲和素之间高度亲和力-特异 稳定 适用性强（与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合） * ELISA试剂的选用和质检 * 影响试剂盒质量的因素 试剂盒的选用 试剂盒的质检方法 目前试剂盒存在的问题 * 影响试剂盒质量的因素 1．原材料 (1)固相材料 商品ELISA试剂盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板，其对ELISA试剂盒的影响在于孔间的显色差异。 (2)抗原 --自然抗原、合成抗原和基因重组抗原。 纯度：纯度不高可致试剂盒的特异性不强。 立体结构：合成抗原一般都是多肽抗原，缺乏完整抗原所具有的立体结构决定簇，可能导致结合上述决定簇的抗体漏检。 * 影响试剂盒质量的因素 (3)抗体 多克隆抗体(多抗)：制备简单，含针对抗原的多种决定簇，但抗体的亲和力和特异性相对要低于单抗，且每次制备的抗体在其亲和力和特异性上均有区别。 单克隆抗体(单抗)：可无限大量的得到针对单一决定簇的抗体，缺点是结合的单一性。当建立双抗夹心ELISA测定方法时，如包被和指示抗体使用同一单抗，则由于结合位点的缺乏，很容易造成假阴性结果，尤其是在使用一步法时“钩状”效应(Hookeffect)的出现。因此，在使用单抗建立双抗夹心ELISA方法时，包被抗体可为混合单抗，从而使得固相抗体在免疫测定中能更为完全地结合待测物中的特异抗原。 * 影响试剂盒质量的因素 (4)酶结合物 ELISA试剂盒的核心部分，通常ELISA试剂盒的有效使用期限即是根据酶结合物的稳定性而定的。 辣根过氧化物酶(HRP)：易于提取，价格相对低廉；性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与抗原或抗体偶联后，活性很少受损失。 碱性磷酸酶(ALP)：碱性磷酸酶用于ELISA必须注意的是含磷酸盐的缓冲液对其酶活性的抑制作用 * 影响试剂盒质量的因素 (5)色原底物：HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(TMB) 。 邻苯二胺(OPD)：OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，当pH值降为1.0时，最大吸收波长为492nm，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。 四甲基联苯胺(TMB)：氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数。试剂盒中常为已配好的A、B两种液态试剂，即一定浓