[自然科学]免疫学试验技术2.pptVIP

二、免疫血清学技术 一、免疫血清学技术 种类： 1. 凝集试验 细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下可逐渐凝集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应（直接凝集试验） 。 间接凝集试验 将可溶性抗原或抗体结合在一种与免疫无关的惰性微粒表面，然后与相应的抗体或抗原作用，在有电解质存在的适宜条件下，微粒即可被动的被凝集，出现肉眼可见的凝集现象。通过微载体进行的凝集试验叫间接凝集试验，也称微载体技术。 常用的微载体：致敏红细胞、聚苯乙烯乳胶、炭粉颗粒 Ag　+　　　　　　 SPA协同凝集试验 葡萄球菌A蛋白（staphylococal protein A,SPA)是葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种动物IgG的Fc片段结合。特异性的IgG的Fc片段与SPA结合后，其Fab片段仍保持与特异性抗原结合的特点而发生抗原抗体反应，从而导致葡萄球菌的凝集。 桥梁凝集试验 又称Coombs抗球蛋白试验，用于检测不完全抗体。单价抗体只有一个抗原结合部位，不会产生凝集反应，当加入抗球蛋白抗体后，可以将两个各连结一个抗原决定簇的单价抗体再连结起来，出现凝集。 2.沉淀试验 可溶性抗原与相应抗体结合所发生的沉淀反应(precipitation)。 如细菌、寄生虫的浸出液、组织浸出液、培养滤液、动物血清等，与相应Ab相遇后在有电解质存在下Ag-Ab复合物相互交联形成免疫复合物达一定大时，可出现肉眼可见的沉淀反应。 沉淀抗原是细胞的浸出成分，为细微的胶体溶液，单个抗原的体积小而总面积大，出现反应需要的抗体量多 沉淀试验可分为环状/絮状沉淀试验、琼脂扩散试验、免疫电泳。 免疫电泳技术 将琼脂扩散试验与电泳技术结合起来的一种免疫检测技术。 在Ag、Ab在凝胶中扩散的同时加入电场作用，使Ag、Ab的扩散速度加快，同时限制了扩散的方向，增加了试验的敏感性。 3、补体结合试验 补体结合试验是可溶性抗原与相应抗体结合后，可以再结合补体，但这一反应不能被肉眼观察到，可加入红细胞及其抗体（溶血素），根据是否溶血来判定反应系统是否存在相应抗原抗体，如红细胞不溶解说明存在相应的抗原抗体，为阳性反应；如溶血则说明不存在相应的抗原抗体，为阴性反应。 　　　检测系统 Ag + Ab 　Ag-Ab 　　Ag-Ab-补体 　　　　 　　　　　　　　　　　+ 补体 　红细胞　 + 　溶血素 　　红-溶 　　　　指示系统 4. 标记抗体技术 标记抗体技术是在抗体球蛋白分子上，连接某一个特定的、容易检测的分子或原子 (标记物)，利用标记抗体能与相应抗原结合的特性，通过标记物的检测，从而确定抗原的存在部位。 标记抗体技术 = 4.1 荧光抗体 4.1.1原理：荧光素在紫外线照射下可发出肉眼可见的荧光，其与抗体结合后仍保持其本身的特性。 荧光抗体与相应抗原结合后，（1）通过荧光显微镜观察可测知抗原的存在及部位； （2）依荧光强弱也可测知抗原量的差异。 4.1.2 荧光抗体的标记 （１）免疫球蛋白（ IgG ）的提取：硫酸铵盐析法、DEAE-纤维素提取法。 （２）荧光抗体的标记：标记Ab常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC，为黄色或橙黄色结晶粉末，最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光）和四乙基罗丹明（RB200，为橘红色粉末，最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595－600nm，呈橘红色荧光）。 FITC的标记如下： 　　 ①浓缩后的IgG、定量、稀释（10~20mg/ml）. ②FITC按蛋白量的1/80－1/100加入。应用pH9.5的0.5M碳酸盐缓冲液将FITC进行溶解。 ③ IgG稀释液与FITC溶液按１０:1配合，FITC液缓慢地加入到IgG稀释液中，防止出泡。 ④避光以电磁搅拌器搅拌，其反应时间与温度有关。 　　　2－4℃须6h 　　　20－25℃须1－2h即可。 　　　一般以低温标记为最好。 ⑤应用透析法、盐析、凝胶过滤法除去未结合的游离荧光素。 4.2.3 应用　主要用于检测抗原 （定性、定位） 　　特点：敏感，需荧光显微镜 　直接法：　 病料（Ag）　　涂片（切片） 　　F-Ab-Ag　　　　　　　　　　　　 　　　　　镜检 　间接法： 病料（Ag）　　涂片　　　Ag-Ab1　　　　　　　　　　　　 　Ag- Ab1-Ab2 -F 　　　镜检 　　直接法　检测一种抗原就须标记一种特异性的AbF ，较