醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白质.docVIP

生物化学实验 醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白质 一、实验目的 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法 二、实验原理 蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。 血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。 蛋白质名称 等电点 相对分子质量 白蛋白 4.88 69000 α1-球蛋白 5.06 200000 α2-球蛋白 5.06 300000 β-球蛋白 5.12 90000~150000 γ-球蛋白 6.85~7.50 156000~300000 在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。 肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。 三、实验器材 1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm） 2、人血清； 3、烧杯及培养皿 数只； 4、点样器； 5、竹镊子； 6、玻璃棒； 7、电吹风； 8、试管 六只； 9、恒温水浴锅； 10、电泳槽； 11、直流稳压电泳仪； 12、7220型分光光度计； 13、剪刀 四、实验试剂 1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml蒸馏水中； 2、染色液，可反复使用； 3、漂洗液：取乙醇45ml，冰醋酸10ml，混匀； 4、浸出液：0.4mol/L NaOH溶液； 5、透明液：取冰醋酸25ml、无水乙醇75ml，混匀。 五、实验操作 1、准备和点样 取一条醋酸纤维薄膜，浸入缓冲液中，完全浸透后，用镊子轻轻取出，将薄膜无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，再放一张干净滤纸吸取多余的缓冲液； 用玻棒蘸取少量血清，涂在点样器上，然后轻轻于距纤维薄膜一端1.5cm处接触，样品即呈一条状突于纤维膜上。待血清透入膜内，将薄膜平贴于已放在电泳槽上、并已浸透缓冲液的纱布上，点样端为阴极； 2、电泳 接通电源，设定电泳电压为100V，通电50分钟； 3、染色 电泳完毕，将薄膜浸于染色液中10分钟，取出，用漂洗液漂至背景无色，再浸于蒸馏水中； 4、定量 将漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下薄膜上各条蛋白质色带，另取一条与各区带近似宽度的无蛋白附着的空白薄膜，分别浸于4.0ml 0.4mol/L NaOH溶液中，37℃水浴10分钟，色泽浸出后，用7220型分光光度计在590nm处比色，以空白膜条洗出液为空白调零，测定各管的吸光度。 5、透明 另外取电泳好的薄膜，待其完全干燥后，浸入透明液中20分钟，取出，平贴于干净玻片上，干燥，即得背景透明的电泳图谱。 六、实验数据记录 蛋白质名称 吸光度 各组分比率% 白蛋白 0.504 65.1 α1-球蛋白 0.038 4.9 α2-球蛋白 0.052 6.7 β-球蛋白 0.097 12.5 γ-球蛋白 0.083 10.8 设各部分吸光率为：。则吸光度总合为： = + +++=0.774 白蛋白比率=/=0.651 α1-球蛋白比率=/=0.049 α2-球蛋白比率=/=0.067 β-球蛋白比率=/=0.125 γ-球蛋白比率=/=0.108 七、实验讨论与总结 1、什么是血清 将抽取的血液置入不加抗凝剂的试管中，使血凝固，析出的上清液就是血清。血清中所含的蛋白成分与血浆相比，少了纤维蛋白原，而主要是白蛋白、球蛋白。由于蛋白的绝大部分均由肝脏合成，所以，各种蛋白质的质与量的变化，除与免疫性疾病等有关外，主要反映肝脏的生理、病理情况。是由醋酸纤维素加工制成的。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：①电泳后区带界限清晰；②通电时间较短（二十分钟至一小时）；③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。从血清中提取的蛋白质，