第二章蛋白质分离纯化技术3.pptVIP

毛细管电泳仪的基本组成 * 毛细管电泳的特点 毛细管: 10 -75 ?m i.d., 20-100 cm in length 分离介质: buffer or gel 进样量: pg, nL 进样方式: pressurized or electrokinetic 柱上检测器: on-line absorbance or fluorescence 分离时间: 30 min 柱效: 100 000- 1 000 000 plates/m * 毛细管电泳的特点 1.仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶 2.分析速度快、分离效率高 分离时间小于30min，柱效105到106 3.操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行 4.应用范围极广 从小分子的无机离子到大分子量的蛋白、核酸 领域涉及分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等 * 毛细管电泳分离模式 毛细管区带电泳（CZE) capillary zone electrophoresis 胶束电动色谱 (MEKC) micelle electrokinetic chromatography 毛细管凝胶电泳(CGE) capillary gel electrophoresis 毛细管等电聚焦(CIEF) capillary isoelectric focusing 毛细管等速电泳 (CITP) capillary isotachophoresis 毛细管电色谱 （CEC） Capillary electrokinetic chromatography * 分离对象与模式的选择 MEKC CEC CIEF MEKC CITP CGE CGE CGE CGE MEKC CITP CZE CZE CZE CZE CZE CZE 病毒/细菌 多肽/蛋白 核酸 糖类 小分子 离子 * 不同分子量蛋白的分离 * * 无胶筛分毛细管凝胶电泳分离蛋白质 PAA PEO HEC 4种碱性蛋白的分离 4种碱性蛋白的电泳分离图。A：涂层管；B：未涂层管。 1：细胞色素，2：溶菌酶，3：胰蛋白酶原，4：α-胰凝乳蛋白酶原 * * 常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素） CM-纤维素（羧甲基纤维素） 开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多。 亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。 回收率高 优点： * 应用实例 阴离子交换色谱 从人血浆中分离得到血清白蛋白(HSA, PI 4.7)和免疫球蛋白G(IgG, PI 5.0) 25mmol／L的乙酸钠缓冲液充分透析血浆 用乙酸将血浆的pH调至5.2 ，除去沉淀 上阴离子交换柱 pH 5.2的乙酸缓冲液洗脱等电点较高的Ig G pH为4.5的同样浓度的同一缓冲液，以阶段洗脱的方式得到HSA 降低pH至4.0，同时升高缓冲液的浓度至150 mmol /L，洗脱得到其他的糖蛋白 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ * 用DEAE-Sepharose CL-6B柱大量分级人血浆蛋白 * 阳离子交换色谱 用CM纤维素分离鸡蛋清中的蛋白质组份 * 凝胶色谱是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛色谱或排阻色谱。 四、凝胶过滤色谱 * 优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，不改变样品生物学活性，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好。广泛应用于蛋白质、核酸等的分离纯化。 缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差。 * 1、原理 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。 * 大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出色谱柱。 小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出色谱柱。 * 2、凝胶过滤色谱的基质 葡聚糖系列 Sephadex用环氧氯丙烷为交联剂，在碱性条件下交联而成的商品凝胶 琼脂糖系列 Sepharose 聚丙烯酰胺系列 多孔硅胶 * 带网孔的葡聚糖珠 小分子进入葡聚糖珠内 大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出 凝胶过滤色谱过程示意图 * 小分子 大分子 凝胶基质 凝胶珠 凝胶过滤色谱过程示意图 * 天