菌种保藏演示幻灯.pptVIP

2.3 菌种保藏 2.3.1菌种的衰退与复壮 2.3.1.1.衰退： 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 衰退的原因：①基因突变， ②分离现象。 ; 常见的衰退现象： 菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降； ; 2.3.1.2 菌种的复壮： 使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。; 菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）； 通过寄主体内生长进行复壮 ； 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）；; 2.3.1.3防止菌种衰退的方法： 控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8—10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代数）；  选择合适的培养条件；  采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；  采用有效的菌种保藏方法。;2.3.2菌种保藏 2.3.2.1 菌种保藏的重要意义 菌种保臧是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。 当然保藏菌种使其不变异亦是相对而言的。实际上没有一种方法可使菌种绝对不变化，所以研究菌种保藏就是要采用最合适的保存方法，使菌种的变异和死亡减少到最低限度。;2.3.2.2 菌种保藏的原理和方法 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。 一种好的保藏方法，首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变。 ; 菌种保藏的方法很多，一般有下面几种： A 斜面冰箱保藏法 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月。 B 沙土管保藏法 这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢的微生物。它的制备方法是：; 首先，将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为l－2∶l混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右，121°C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用80目过筛，土用30－100目过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为1年左右。 C石蜡油封存法 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。;D真空冷冻干燥保减法 真空冷冻干燥保臧法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低的温度下（－15℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。 因此，菌种可以保存很长时间，一般5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。 ;（3）冻结 液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。 美国 ATCC采用先将菌液降温到0℃，再以每分钟降低1℃的速度，一直降低到－38℃，然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰晶状态发生变化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮的残存量，定期补加。 （4）重新培养 当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或35－40℃水浴中迅速解冻，当升温至0℃时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。 我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种。; 几种常用菌种保藏方法