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第五章 沉淀反应 凝集反应和沉淀反应的不同点 第一节 液相沉淀试验 一、絮状沉淀试验 ( flocculation test) 二、环状沉淀试验 第二节 凝胶内沉淀试验 原理： 可溶性Ag和相应Ab在凝胶中扩散，形成 浓度梯度，在Ag与Ab浓度比例适当的位 置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用凝胶：琼脂(糖)。 琼脂(糖)：加热至100℃时融化，冷却至45℃时 重新凝固。 适宜浓度的凝胶可视为固相的液体，水分占98%以上。 凝胶的特点： ①凝胶呈网络状结构，可将水分固相化。 ②Ag、Ab在凝胶中可自由扩散。 ③扩散速度与分子大小相关： 小分子，扩散快；大分子，扩散慢。 可利用此点来识别待测物分子量的差别。 ④ Ag-Ab复合物分子量超过百万，被固定在凝胶中相应位置。 凝胶内沉淀试验的类型： 1、单向琼脂扩散试验： 原理：凝胶中含一定量抗体, 加入抗原, 抗原 在琼脂内自由扩散，在一定区域内形成 可见的沉淀线/环, 常用于抗原定量分析。 2、双向琼脂扩散试验： 原理：琼脂内抗原、抗体各自向对方扩散， 在最适当的比例处形成抗原－抗体沉淀 线。常用于抗原、抗体定性分析。 一、单向琼脂扩散试验 单向琼脂扩散试验抗原含量的计算方法： 1、Ｍancini曲线： 适用范围：Ag为大分子,扩散时间(48h), 用方格纸画曲线。 计算公式：c=kd2。 2、Ｆehey曲线： 适用范围： Ag为小分子，扩散时间短(24h)。 用半对数坐标纸画线。 计算公式：logc=kd。 对待检蛋白质样品定量测定的条件： 1、具有单价特异性抗血清 2、已知含量标准品（绘制标准曲线用） 3、待检含量1.25ug/ml。（敏感度稍低） 单扩试验的应用范围： 常用于IgＧ、IgＡ、IgM、C3、C4等测定， 简易的抗原定量技术。 影响因素 二、双向琼脂扩散试验 Ａg性质的分析（三角形孔） 第三节 免疫电泳技术 （immunoelectrophoresis） 影响因素 一、对流免疫电泳(CIEP) 对流免疫电泳 结果： 　　　ＡgAb在比例合适处形成沉淀线。 　 二、火箭免疫电泳(RIE) 三、免疫电泳(IEP) 四、其它免疫电泳技术 （一） 免疫固定电泳(IFE) 免疫固定电泳 方法： 待检蛋白电泳→贴浸有抗血清的滤纸→ 抗原与对应抗体反应→沉淀→漂洗→染色→某一抗原的存在? （二）免疫选择电泳(ICE) （一）透射比浊法 （二）散射比浊法 1.速率散射比浊法 2.终点散射比浊法 （三）免疫胶乳比浊法 免疫浊度测定的影响因素： ① 抗原抗体比例(在反应体系中保持Ab过量)； ② 抗体的质量(特异性强，效价高，亲和力强， R型抗体)； ③ 反应的溶液（pH6.5~8.5, 磷酸盐缓冲液）； ④ 增浊剂的使用。 应用：定量测定液体中的微量抗原、抗体等。 抗原抗体的比例对沉淀反应的影响： 可用马蹄形沉淀曲线来描述。 当抗原过量时，表现为高剂量的钩状效应。 当抗体过量时，表现为海得堡曲线。 示意图 不适宜抗原抗体都是球蛋白的检测 IgG1和IgG2：向负极泳动 IgG3和IgG4：向正极泳动 示意图 I=3～4mA/cm + 1：Ag与Ab对应； 2：Ab＞Ag，Ag为 弱阳性 3：Ag＞＞＞Ab， Ag强阳性 4：Ag＞＞Ab，Ag含量较高； - 原理 　 单扩＋电泳 把抗原放在含有抗体的凝胶内电泳，其沉淀形似火箭。 操作步骤 (rocket immunoelectrophoresis) 概念 待测Ag在含适量Ab的琼脂板中泳动时，Ag与Ab达到适当比例形成大的不溶性IC而不再移动，未与Ab结合的Ag可继续向前泳动，并形成新的沉淀，随着Ag的减少，沉淀带越来越窄，形似火箭峰状。 方法评价： 简便、快速、 敏感度高， 测0.3mg/L、 重复性好 1.抗体混于凝胶中 2.抗原加入孔内 3.抗原定向向正 极泳动 4.形成沉淀峰 示意图 + 6～8mm 5mm 沉淀峰高 抗原浓度 1.测定沉淀峰高度 2.在标准曲