第六章 分子克隆常用的载体.ppt

第一节??????? 质粒载体 一、质粒的基本特性 二、质粒的分离纯化方法 三、质粒载体的选择 四、大肠杆菌质粒载体 五、多种功能的衍生质粒的组建 一、质粒的基本特性 1．质粒 2．质粒的命名 3．质粒的种类 4．质粒的复制类型 5．质粒的分子生物学特征 二、质粒的分离纯化方法 1．氯化铯溴乙锭浮密度超速离心密度梯度分离法 （图6-3） 2. Triton和PEG化学提取法 3．煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质粒DNA 4．碱变性法抽提质粒DNA 质粒的存在形式：呈共价闭合环状 ①超螺旋的SC构型 （cccDNA） ②松弛开环的OC型 （ocDNA） ③松弛线性的L构型（cDNA） 基本步骤： 细菌生长和质粒的扩增 菌体收获和溶菌 质粒纯化 氯化铯浮密度分离法 当各种DNA分子在有饱和溴乙锭染料存在下进行氯化铯密度梯度离心时，与共价闭环状分子结合的染料要大大少于与开环状或线状DNA的结合，因此，在氯化铯梯度离心中质粒DNA与染料相结合后生成的条带是在较高的密度范围内，而断裂为线状的染色体DNA与溴乙锭结合较多，生成的条带是低密度范围。所以，离心后形成2条带，上面的条带主要是染色体DNA及少量开环状质粒DNA，下面的带则是共价闭合环状质粒DNA。 碱变性法抽提质粒DNA 该法也是一种快速抽提质料DNA的方法。其分离原理，大肠杆菌的染色体约有4700KB长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的PH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链便分离成单链，而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢链被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当PH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。 三、质粒载体的选择 作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件（1）能自主复制，即本身是复制子（2）具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；（3）在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征，（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。 四、大肠杆菌质粒载体 1． pSC101质粒载体 2．pBR322质粒载体 分别由pMB1 (ori)、pSF2124(Ampr ) 和Psc101(Tetr) 三种质粒通过载体改造后形成，使之具有松弛型ori和Ampr及Tetr两种抗性基因的理想的基因克隆载体。 Ampr （Scal、PvuI、PstI切点 ） Tetr （EcoRI、Nhel、BamHI、SphI、HindIII切点 ） 五、多种功能的衍生质粒的组建 （一）、带有不同种类抗性基因的质粒载体 （二）、高拷贝数质粒pAT153 （三）、正选择质粒 （四）、多功能质粒-PUC质粒 带有不同种类抗性基因的质粒载体 pBR328是从pBR322改建成的质粒，大小为4.907kb,它具有Ampr、Tetr和Cmlr基因。Cmlr基因有EcoRI、PvuⅡ和BalI的单一酶切位点。除了pBR328外，pBR325也有类似结构。 pAT153是由pBR322质粒改造而成，这种质粒的拷贝数比pBR322高1.5～3倍。它的大小是3.6kb,选择标记有氨苄青霉素抗性基因Ampr和四环素抗性基因Tetr、单一切点的限制性内切核酸酶有PvaⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、ClaⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ。 正选择质粒 pTR262是正选择质粒。在这种质粒中，在四环素的抗性基因（Tetr）前有λ噬菌体的PR启动子，同时在这种载体中还带有λ噬菌体编码CI蛋白质（阻遏物）的基因。没有外源基因插入时，由于CI蛋白质阻遏从PR进行的转录作用，因此对四环素不表现抗性。在CI蛋白质基因上有单一的HindⅢ和BclⅠ切点，若利用其中任何一个切点插入外源DNA片段，都可以使CI蛋白质基因功能丧失，结果PR激活Tetr基因表达；表现出对四环素的抗性，达到正选择的效果。 第二节??????? 噬菌体载体 一、噬菌体的一般生物学特性 二、λ噬菌体载体 三、粘性质粒 四、单链DNA噬菌体载体 烈性噬菌体 温和噬菌体 溶源化细菌 溶源化 原噬菌体 二、λ噬菌体载体 （一） λ DNA分子 (1) λ噬菌体基因结构：如图6-11、6-12 Cos位点（Cohesive-end site）： λDNA为线状双链分子，两端各有几个碱基的单链互补粘性末端，通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。这种由粘末端结合形成的双链区段即Cos位点。 (2) λ噬菌体DNA的复制 （二）λ噬菌体的类