ELISA（标记免疫技术）.ppt

标记免疫技术 50年代：荧光免疫 60年代：放射免疫 70年代：酶免疫 酶标记技术 酶免疫组织化学技术：组织切片或其它标本中抗原或抗体的定位 酶免疫测定：液体标本中抗原或抗体的测定 酶免疫测定 均相： 非均相： 酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA 基本原理 抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持免疫活性 酶与抗原或抗体结合形成酶标抗原或抗体，既保留免疫活性，又保留酶的活性 受检标本与酶标抗原或抗体先后与固相载体表面的抗原或抗体反应，通过洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开 结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定比例 ELISA特点 敏感性高 特异性强 重复性好 简便快速 ELISA基本类型 双抗体夹心法 测抗原 双抗原夹心法 测抗体 间接法 测抗体 竞争法 测抗体、测抗原 捕获包被法 测抗体 双抗体夹心法 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰 间接法 主要用于对病原体抗体的检测 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法 间接法成功的关键在于抗原的纯度，应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性 血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质封闭固相上的空余间隙 双抗原夹心法 反应模式与双抗体夹心法类似 与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体 关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法 竞争抑制法 竞争法测抗体 竞争法测抗原：小分子抗原、半抗原 IgM 抗体捕获法 IgM是初次体液免疫应答早期阶段产生的主要Ig，检测IgM水平可用于传染病的早期诊断中 用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM，然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关 ELISA试剂 固相载体 酶结合物 酶的底物 固相载体 聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性 载体形状：微量滴定板、小珠和小试管 标准：吸附性能好，空白值低，孔底透明度高 包被 抗原或抗体结合到固相载体表面的过程 抗体：直接包被法 抗原：捕获包被法 包被抗原 天然抗原： 重组抗原： 合成多肽抗原： 包被抗体 具有高亲和力和高特异性 包被条件 包被缓冲液：PH9.6 CBS、 PH7.2 PBS、pH7-8 TBS 包被温度与时间：4-8℃冰箱中放置过夜；37℃中保温2小时 包被的蛋白浓度 ：100ng/ml-20ug/ml 封闭 包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附 封闭剂 0.05%-0.5%的牛血清白蛋白 10%的小牛血清 1%明胶 脱脂奶粉（5%） 酶结合物 既有酶的高催化活性，又保留抗原（抗体）的免疫活性 良好的稳定性 酶 要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶 相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等 常用酶: 辣根过氧化物酶( HRP)和碱性磷酸酶(AP) 酶结合物制备 戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结，碱性磷酸一般用此法进行标记 过碘酸盐氧化法：适用于含糖量较高的酶，辣根过氧化物酶的标记常用此法，反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合 底物 HRP: 邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS AP: 硝基苯磷酸酯(p-NPP) ELISA测定步骤 固相包被 ? 封闭 ? 加待测标本 ? 温育 ?洗涤 ? 加酶标物 ? 温育 ? 洗涤 ? 加底物 ? 温育 ? 加终止液 ? 比色 ? 判定结果 加样 应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡 加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中，每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染 保温 温度：43℃、37℃、室温和4℃ 保温方式：水浴、保温箱 洗涤 浸泡式 流水冲洗 洗板机 洗涤液 PBS