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第三章 生物制品的制备P62 细胞破碎 定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜 目的：破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。 细胞破碎是生物大分子初级分离纯化的第一步，也是一个重要环节，它直接影响了产物的加收率及纯度 一、机械破碎方法 通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。 高速组织捣碎机 手提式匀浆器 研磨器 物理破碎方法 通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎方法。 物理破碎方法多用于微生物细胞的破碎。 化学破碎方法 化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。 常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。 十二烷基硫酸钠：SDS 酶学破碎方法 酶学破碎方法：利用溶解细胞壁的酶(外加的或细胞本身存在的酶)处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞膜 分为：外加酶制剂和自溶法。 自溶作用 自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。 由于各种糖类制品的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法。 三、糖类制品的分离纯化方法 非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。 降解法适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。如从软骨中分离提取硫酸软骨素，就是用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。 （1）提取方法 常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。 乙醇沉淀法：是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分离。4-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵（CTA）等。 （2）分离方法 （1）提取方法（extraction ） 脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键，将脂质溶解出来。常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等。 四、脂类制品的分离纯化方法  沉淀法 ：由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。 吸附层析法：常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极性的后流出。 （2）纯化方法 离子交换层析法: 脂质分子的存在有非解离、两性离子和酸式解离三种状态。根据它们在一定pH条件下的解离情况，选择适当的离子交换剂可将它们提纯。如TEAE—纤维素对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。 （1）氨基酸的生产方法 蛋白质水解法：水解法有酸水解、碱水解和酶水解三种。 五、氨基酸类制品的分离纯化方法 ①用盐酸水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是L—型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。 ②碱水解法易产生消旋作用，较少应用。 ③酶水解法水解不够完全。 发酵法： 菌株经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。 化学合成与酶促合成法 化学合成法一般得到的是DL—型氨基酸，尚需要对异构体拆分；酶促合成法也是酶工程在医药工业上的应用，优点是技术工艺简单，转化率高，副产物少和易提纯等。 有沉淀法、吸附法和离子交换法。 沉淀法：根据形成沉淀的原理不同分为两种：①是依据不同氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度差异进行沉淀分离。②是用特殊试剂沉淀某种氨基酸，如用邻二甲苯-4-磺酸与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来。 （2）氨基酸的分离方法 吸附法：这是利用吸附剂根据氨基酸吸附力的差异进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理。 离子交换法：氨基酸是两性电解质，在一定pH条件下，不同氨基酸带电性质及解离状态是不相同的，因此在离子交换剂上被吸附的强度不同。常用的离子交换剂为强酸型阳离子交换树脂，洗脱主要用pH梯度洗脱。 基因工程产物的特点： 产物大多数处于细胞内，需进行细胞破碎 产物浓度较低，杂质多，提纯困难 产物多是大分子蛋