小鼠角质细胞生长因子重组腺病毒载体的构建-中华危重病急救医学.PDFVIP

维普资讯 ·610 · 国丘重瘟叁敦医学2007年10月第 19卷第 10期 ChinCritCareMed，October2007，Vo1．19，No．10 · 论 著 · 小鼠角质细胞生长因子重组腺病毒载体的构建 陈力 张心灵 李银平 王建莉 黎檀 实 【摘要】 目的 探讨构建表达小鼠角质细胞生长因子(KGF)基因重组腺病毒载体的方法。方法 提取 小 鼠肺组织 RNA，经逆转录一聚合酶链反应 (RT—PCR)获得 cDNA后 ，PCR扩增 目的基因片段 。将获得的 KGF基因插入载体质粒 pShuttle—CMV，构建穿梭质粒 pShuttle—CMV—KGF(pKGF)。线性化 pKGF后 ，转 化人含 AdEasy一1病毒骨架 的BJ5183细菌 中。筛选正确的同源重组质粒 pAdEasy～1～pShuttle—CMV— KGF(pAd—KGF)，转染 HEK293细胞 ，产生病毒颗粒AdEasy一1一pShuttle—CMV—KGF(Ad—KGF)。进一 步大量扩增病毒 ，氯化铯梯度离心纯化 ，测定病毒滴度 。制备病毒 Ad—GFP为对照，显微镜下观察转染率 。 结果 ①经限制性内切酶酶切和基因测序鉴定，证实pKGF构建成功；②限制性 内切酶酶切确定穿梭质粒重 组于病毒骨架 ；显微镜下观察HEK293细胞形态 ，证实病毒包装复制成功；⑧病毒滴度 3．0×10 pfu／ml，达 到进一步体内、外实验要求 。结论 成功构建 了重组腺病毒Ad—KGF，为 了解KGF在肺部疾病 中的作用以及 进一步的基因治疗肺纤维化方法奠定了基础 。 【关键词】 角质细胞生长 因子 ； 腺病毒 ； 小鼠； 肺 Construction ofrecombinantadenovirusvectorofmousekeratinocytegrowthfactor CHEN Li ．zHANG Xin—ling，LIYin—ping，WANGJian—li，LITan—shi． DepartmentofEmergency，theGeneralHospitalof P ，Beijing100853．China Corresponding author：￡，Tan—shi [Abstract] Objective Toconstructarecombinantadenovirusvectorexpressingkeratinocytegrowth factor(KGF)geneinmouse．M ethods KGFgeneamplifiedfrom mousecDNA bypolymerasechainreaction (PCR)．Itwasreversetranscriptedfrom RNA thathadbeen harvestedfrom C57BL／6mouse。and then insertedintotheplasmidpShuttle—CMV toconstructtheshuttleplasmidpShuttle—CMV —KGF (DKGF)． After1inearizedbyrestrictionenzyme，theplasmidwastransformedintoE．ColiBJ5183containingadenovirus backbone．ThehomologousrecombinantpAdeasy一1一pShuttle—CMV —KGF (DAd～KGF)wasidentified， 1inearized． and then transfected into HEK293 cells using the 1ipofectamineTM 2000 to package the adenovirus，Adeasy一1一pShuttle—CMV —KGF (Ad—KGF)。followedbyfurtheramplification，caesium chloridedensitygradientcentrifugation purificationand measurementofvirustiter．Ad～GFP wasusedas contro1，anditstransfectionefficacywasobserved．Results ①TheshuttleplasmidpKGFwasprovedtob