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生物急毒性檢測方法－水蚤靜水式法 NIEA B901.13B 一、 方法概要 　　本方法主要係以水蚤（Daphnia）為試驗生物，以靜水式生物毒性試驗方法，檢測生物急毒性，並計算48小時之半數致死濃度（lethal concentration 50%, LC50）或急毒性單位（acute toxic unit, TUa）。 　　本方法適用於地面水體、地下水體、放流水、廢水、污水、水源水質及環境用藥之生物急毒性檢測。 (一) 生物馴養及毒性試驗室內若有化學氣體侵入、馴養水或稀釋水含有有毒物質、器皿或試驗容器未洗淨致殘留有毒物質，會影響水蚤健康且可能造成耐受性改變。 () 水蚤因飼料品質不佳、餵食量不足或水質劣化等因素，導致健康狀況不佳，影響耐受性。 (一) 水蚤：使用Daphnia pulex或Daphnia magna，水蚤型態如圖一及圖二。應紀錄水蚤來源，分類鑑定可參考十一、(一)及十一、(二)。 () 生物馴養及毒性試驗室（箱）：須為獨立之空間，通風良好，無化學氣體影響，且可屏蔽外界干擾（如噪音、震動、強光、人為驚擾等）。馴養及試驗區域宜加以區分，以避免污染。光照強度同一般工作亮度。 () 溫度控制設備：可使用循環式水浴槽、空調、恆溫培養箱等方式，將馴養水溫及試驗水溫控制在25 ± 2℃。 () 採樣容器：玻璃或塑膠材質。如使用塑膠材質容器，不可重複使用。 () 馴養容器：可使用體積2 L以上之硼矽玻璃燒杯。 () 試驗容器：30 mL以上之硼矽玻璃容器或拋棄式聚苯乙烯（polystyrene）容器。 () 量瓶及量筒：硼矽玻璃材質。 () 廣口滴管：開口直徑須為4 mm以上，亦可將塑膠滴管剪短替代。 () 溫度監測裝置：須可顯示毒性試驗期間試驗水樣之最高及最低溫度。 () 溶氧測定儀。 () pH計。 () 導電度計。 () 餘氯計。 () 水質硬度計：亦可使用水質硬度檢測試劑組。 () 分析天平：可精秤至0.1 mg。 () 曝氣設備。 () 均質機（blender）：水蚤飼料配製用。 () 水蚤飼料：選取下列成份混合配製而成，配製方法詳見附錄一： 魚飼料：1號鱒魚飼料、薄片飼料或成份類似之魚飼料。 ２、 乾酵母粉：酵母粉內之酵母菌含量會隨時間遞減，故建議使用新鮮之烘焙用酵母粉。 ３、 草葉粉：小麥草葉粉、大麥草葉粉或紫花苜蓿草葉粉。 ４、 螺旋藻粉及小球藻粉。 五、 試劑 (一) 試劑水：比電阻值須大於10 Megohms-cm。 () 稀釋水：D. pulex使用中硬度稀釋水，D. magna使用高硬度稀釋水，成份如表一，添加試劑純度須為試藥級以上。可根據檢測需求量，依配方比例配製。20 L稀釋水之建議配製程序如下： 將碳酸氫鈉、七水硫酸鎂及氯化鉀加入18 L試劑水中，曝氣隔夜使試藥充分溶解。 ２、 將二水硫酸鈣加入2 L試劑水中，充分攪拌使其完全溶解後，再加入前述18 L液體中。 　　試藥完全溶解後，劇烈曝氣至少8小時，再測定硬度是否落於建議範圍。室溫下避光保存不宜超過14天。 () 馴養水：可使用稀釋水、去氯自來水（註1）、無污染之地下水等作為馴養水。馴養水之硬度應與稀釋水一致，可混合適量之逆滲透水或試劑水進行調整。 () 參考毒物：氯化鈉，試藥級以上。 () 10%（v/v）鹽酸或硝酸：試藥級以上。 () 丙酮：殘量級。 (一) 放流水採樣方法參照「事業放流水採樣方法（NIEA W109）」之規定。水樣量至少500 mL。 () 採樣時樣品容器應裝至全滿，以減少揮發性物質散失。採樣後立即避光保存於4 ± 2℃。 () 水樣必須在採樣後36小時內開始進行確定試驗。 (一) 試驗準備 １、 水蚤馴養：如附錄一。 ２、 試驗容器清洗： (１) 新的塑膠器皿，使用前須用稀釋水潤洗1次。 (２) 新的玻璃器皿，需用新鮮配製之10%（v/v）鹽酸或硝酸浸泡一夜後，再用試劑水沖洗乾淨。使用前以稀釋水潤洗1次。 (３) 接觸過放流水的玻璃器皿（如試驗容器、量筒等），如須重複使用，則必須依下列步驟清洗： (a) 自來水浸泡15分鐘後，用清潔劑刷洗內壁，再以自來水沖洗2次。亦可使用洗瓶機清洗。 (b) 以新鮮配製之10%（v/v）鹽酸或硝酸潤洗1次。 (c) 以試劑水潤洗2次。 (d) 以丙酮潤洗1次。 (e) 以試劑水潤洗3次。 (f) 進行毒性試驗前，再以稀釋水潤洗1次。 ３、 試驗前之水樣準備： (１) 先將水樣靜置半小時待粗顆粒沈降後，再取上層液進行試驗。 (２) 水樣溫度須調整至25 ± 2℃。若回溫後溶氧低於3.0 mg/L，應對水樣溫和曝氣，使溶氧升至3.0 mg/L以上。 ４、 時齡不超過24小時之水蚤製備：製備方式如附錄一。試驗開始之2小時前須先餵食。 (二) 範圍尋找試驗（range-f