[生物学]第二章 蛋白质分子设计 - 简.ppt

第二章 蛋白质分子设计  Chapter two Protein Design  一、蛋白质分子设计的分类 设计的目的主要有两个： 一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性等； 二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。 （一）蛋白质分子设计的层次 分为两个层次： 一是在蛋白质三维结构已知基础上的分子设计 ； 二是在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工作。 （二）蛋白质分子设计的分类 1．定点突变或化学修饰法 2．拼接组装设计法 3．从头设计全新蛋白质 二、蛋白质分子设计的原则 1．活性设计 2．对专一性的设计 3．Scaffold设计(框架) 4．疏水基团与亲水基团需合理分布 5．最优的氨基酸侧链几何排列 序列设计 设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成α螺旋的残基； 设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于形成β折叠片的残基； 而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。 溶菌酶结构 设计步骤 第二节 基于天然蛋白质结构的分子设计 基于天然蛋白质结构的分子设计有两类 ： 一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，即“小改”； 二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中改”。 一、定位突变 基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。 （一）定位突变的设计目标及解决方法 定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的 热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专 一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关 系的研究等。 Hartley等于1986年完成了一个设计目标及解决的办法 ： 热稳定性 对氧化的稳定性 对重金属的稳定性 pH稳定性 提高酶学性质 引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积 把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr 替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu 替换表面荷电基团，His、Cys以及Tyr的置换 专一性的改变，增加逆转数， 改变酸碱度 （二）定位突变的种类 要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。 根据基因突变的方式，分为以下三类： 插入一个或多个氨基酸残基； 删除一个或多个氨基酸残基； 替换或取代一个或多个氨基酸残基。 要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。 （三）定位突变的程序 可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。 2．找出对所要求的性质有重要影响的位置 在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。 3．预测突变体的结构 根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较 4．构建突变体，获得突变体蛋白 依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。 5．突变体蛋白质的检验 测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等， 并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果， 同时进一步修正设计方案。 1．根据结构信息确定残基的突变 最有效最直接的方法 Alan Fersht和GregWinter等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的Ser所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3’羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。 2．突变方法鉴定突变功能残基 随机突变技术 删除分析及连接片段扫描突变 3．利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基 高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关 。 非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。 探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴