转基因暗蚊影响疟原虫的传播的翻译(nature).doc

转基因蚊影响疟原虫的传播 程伟 2012202601 （华南农业大学动科院，广州，510642） 疟疾估计每年能引起700000-2700,000的死亡，但是由于许多未报道诊断的难度实际数字实质上更高。如果没有新的防控措施出现，疟疾的死亡代价预计将在接下来的20年翻倍。由于疟原虫Plasmodium parasites）的抗药性，蚊子对杀虫剂的抵抗性以及缺少有效的疫苗，控制这一疾病的努力被阻碍。由于蚊子是疟疾的必要，疟疾的传播可以通过致使传播寄生虫来缩减。许多传播疟疾的蚊子基因操控工具已被。外源基因也能被引入库蚊和蚊的种系中，并且这些转基因能组织特异性形式中表达。这里我们报道了使用这种工具产生在中肠上皮能表达寄生虫基因的转基因，因致使它们成为无效的。这些发现对开发新的控制疟疾策略有明显暗示作用。 当蚊子消化来自感染宿主的血粉，疟原虫配子体转变成配子，配子交配并分化成受精卵，然后分化成动合子（ookinetes）（加长有活力的受精卵）。动合子穿过中肠上皮分化成卵囊，10~15天释放孢子体到血腔。当孢子体穿过唾液腺上皮，寄主在蚊子中的发育完成。寄生虫穿过中肠上皮的机制尚不清楚，但怀疑是受体介导的。源自噬菌体基因库的体内选择随机地展现大约12多肽类氨基酸，导致鉴定出一个多肽-PCQRAIFQSICN(术语是SM1，代表唾液腺和中肠粘合肽1)——专门粘合寄生虫穿过的两个中肠上皮唾液腺上部裂片和中肠内腔表面。显然，SM1强烈地抑制寄生虫穿过这两个上皮细胞。这些结果表明，当感染的血粉被消化时，若SM1产生并且分泌到蚊子中肠内腔，然后疟原虫发育将被堵塞。 我们寻找一种体系去驱使那些抑制疟原虫发育的基因表达，然后发现羧肽酶（CP）操纵子和羧肽酶信号序列有许多令人满意的贡献。CP操纵子强烈地被血粉激活， CP信号肽序列驱使蛋白分泌进入中肠内腔，疟原虫的最初发育阶段就是在中肠内腔发生。我们创建了一个综合基因（术语是AgCP[SM1]4），由四个SM1单位联合4-氨基酸连接肽附在CP信号肽序列，并且被肠道特有的和血液诱导的CP操纵子所驱动。此基因被插入到一个piggyBac载体中，并且转化入Anopheles stephensi）种系。394个胚胎注射，63（16%）幼虫孵化，产生13个成虫（84%），成虫被分成14个属，其中两个属（属A和属B）产生绿色荧光蛋白（GFP）阳性后代。后代来源于两个分开的蚊子品系（从对每一个属所做的Southern blot分析）。结果表明，四个品系中的每一个均源于不同的综合体。Northern blot 分析表明，AgCP[SM1]4 转基因是迅速和强烈的被转基因蚊子中肠血粉诱导，在3~6 h达顶峰（图1 d），这一模式符合预先观察：基因被冈比亚按蚊Anopheles gambiae）羧肽酶启动子驱动。我们调查了中肠上皮AgCP[SM1]4综合体，使用免疫荧光显微观察。这种重组蛋白在饲喂血粉6 h和24 h的蚊子中肠上皮中被检测到，但到了36 h，这一信号已经减弱到接近基础水平。因为动合子在大约饲喂血粉24 h后侵入中肠上皮，重组多肽的合成与分泌先于寄生虫的侵染是很重要的。 先前的试验表明当感染的血粉和SM1肽一起被饲喂，卵囊的形成被抑制，动合子ookinetes）的形成不被抑制。为了测定AgCP[SM1]4转基因表达在寄生虫发育上的结果，我们把对照组和转基因蚊子饲喂给相同的小鼠并且测定形成的数量。在九个试验中，抑制形成范围在68.7%到94.9%（平均抑制是81.6%；表1）。为了确定对照和转基因蚊子品系有相同的遗传背景，这四个转基因品系在每一代被与野生型蚊子种群回交。我们考虑这样一种可能性，观察到的结果被转基因整合上的内因性蚊子基因或一些其它转座子特性偶然破坏。两系的证据不支持这种可能性。第一，卵囊形成相等的抑制在三个独立导出系的蚊子中观察到。注意每一个参考系，转基因集成在蚊子基因组的不同位置（图1c）。第二，疟原虫在转基因斯氏按蚊（A.stephensi）（基于Minos的转座表达GFP）中的发育是与疟原虫在野生型蚊子中发育区分的（F.Catteruccia，个人交流）。因此，它们自己出现的外源DNA或表达GFP不影响寄生虫的发育。而且SM1肽，但不是对照肽，当给予蚊子时强烈抑制寄生虫发育和传播。这些观察结果表明这些表达的肽序列很重要，并且在蚊子体内的抑制疟原虫发育能导致SM1表达，而不是转化成载体。SM1可能粘到蚊子中肠受体，这也需要动合子。可能SM1四聚体粘到中肠内腔表面，抑制寄生虫与中肠上皮相互影响和中肠入侵。 转基因蚊子对感染（卵囊负载）不易感，并且比对照组蚊子的唾液腺中含有更少的孢子体（表1和表2）。而且转基因蚊子载体潜力也受到严重影响。在三次试验中的两次，没有检测到传播，在第三次试验