利用Red同源重组技术构建产L_苏氨酸的基因工程菌.pdfVIP

China B iotechnology, 2010, 30( 3): 7984 Red * L 1, 2 1, 2 2 2 1 2** 闫继爱 张 雪 张 芸 左佃光 陈 宁 温廷益 ( 1 300457 2 100101) 利用 Red重组技术构建不同基因突变的 L苏氨酸工程菌大肠杆菌 I HR, 研究单敲除 m etA ilvA 和双敲除m etA ilvA 基因 对 L苏氨酸积累的影响应用质粒 pKD46介导的 Red 同源 重组系统, 通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因, 再通过重组酶在 FR 位点 发生第二次同源重组, 消除抗性基因, 成功敲除了菌株 I HR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中 的m etA 和 ilvA 基因, 构建了三株不同的基因突变株将携带苏氨酸操纵子的工程质粒 pWYE065 电转化入敲除不同基因的突变株中, 构建基因工程菌经 5 L发酵罐发酵产酸实验, 未敲除任何 基因的菌株 I HR /pWYE065 L苏氨酸的产量为 5. 55 0. 51 g/L, m etA 基因单敲除菌株 I HR m etA /pWYE065 L苏氨酸产量为 9. 77 1. 83 g/L, ilvA 基因单敲除菌株 I HRilvA /pWYE065 L苏氨酸产量为 8. 65 1. 42 g /L, 同时敲除 ilvA 和m eAt 基因的菌株 I HRm etA ilvA /pWYE065 L苏氨酸的产量增加到 13. 6 1. 14 g/L通过敲除 L苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因, 可以增强 L苏氨酸积累的效果, 为L苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础 大肠杆菌 R ed同源重组 基因敲除 L苏氨酸 发酵 Q784 L, , [ 13] L , , , [ 4] 2005L 7 L [ 5] , , , , , , L, L L ( B rev ibacter ium L, Red f lavum ) ( Corynebacterium g lutam icum ) I HR L (E scherich ia coli) , E. coli m etA L ilvA , [ 6] L , L pWYE065, 5 L L , L : : L * 863( 2006AA02Z216) ** , : w enty@ mi . ac. cn 80 China Biotechnology Vol. 30 No. 3 2010