[自然科学]PCR引物设计.ppt

PCR引物设计 PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。 引物设计的基本原则 引物要跟模板紧密结合； 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在； 引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。 引物设计要点 ①引物长度：引物的长度一般为15-30 bp，常用的是16-24 bp，但不应大于38 bp 。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 　　 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。 G+C含量太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的GC含量不能相差太大。 ④应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。 ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。 引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 ⑤避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体和发夹结构，产生非特异的扩增条带。引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5（绝对值）。 发夹结构（Hairpin） 自身互补 二聚体（Dimer） 两个引物间互补 ⑥引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 引物3′端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 3′端防止连续三个C或G。 ⑦引物的Tm值。过高（72℃）或过低（37℃）都不利于引发反应。上下游引物的Tm 不能相差太大（5 ℃ ）。 ⑧引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 可参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。 ⑨引物的特异性：引物应与非目的基因区的模板DNA序列无明显同源性。 点击该按钮 ，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 ，只有 。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。 5′加入酶切位点 Oligo 6.71使用技巧简介 Oligo 6.71的启动界面如下： 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。 如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。 第三项检查为GC含量和Tm，以45-55％为宜，并且应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近。 * * PCR原理 高温变性 低温退火 适温延伸 理论上，只要知道任何一段模板序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 PCR引物 是人工合成的两段寡核苷酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 PCR产物长度 ≤ 500bp 引物长度 16～18 bp PCR产物长度≈5kb 引物长度≈25bp 纪录： 23bp长度引物扩增出40kb产物 Tm值的计算： 一般的公式（较短的引物时） Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，最好没有错误引发位点，可以保证不出现非目的产物的条带。 Primer Premier 启动界面 Primer Premier 5.0的使用技巧简介 复制序列粘贴到此处 进行引物设计时，点击 按钮 如果没有特殊要求，建议使用默认设置。 引物长度 引