L-酪氨酸的酶法合成及分析.pptVIP

L-酪氨酸的酶法合成及分析;一、L-酪氨酸背景知识;【性状】 l-体从水中结晶出来者，无色至白色丝光针状结晶或结晶性粉末；d-体从水中结晶者为无色晶体；dl-体从水中结晶者为有光泽的针状晶体。为动物体内非必需氨基酸！ 【制备或来源】 ⑴由含蛋白质的物质（废丝、酪蛋白和玉米等）水解液中提取； ⑵以葡萄糖为原料，经短杆菌出发诱导的l-酪氨酸生产菌发酵而得； ⑶以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利用β-酪氨酸酶催化制取。; 【用途】 与糖类共热可产生氨基羰基间的反应，而产生一种特殊的香料。必需氨基酸。 酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底物，是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料。在美白化妆品研发中，可以通过研究合成与酪氨酸竞争的酪氨酸酶结构类似物也可有效地抑制黑素的生成。 白癜风患者吃含有酪氨酸的食物可以促进黑色素的形成，减轻白癜风症状。 医药???作甲状腺功能亢进；食品添加剂。 是一种重要的生化试剂，是合成多肽类激素、抗生素、L-多巴等药物的主要原料。 广泛用于农业科学研究，也作饮料添加剂和配制人工昆虫饲料。 ;二、L-酪氨酸的酶法合成;TPL催化L-酪氨酸裂解的最适pH为8．2，pH6．0时该酶基本没有活性。一般认为这种高、低pH情况下的酶活差异是由于pKa约为7．8的二种催化碱的质子化引起的。 酪氨酸酚裂解酶主要分布于肠细菌内，也存在于一些嗜热菌和节肢动物体中，其中酶活较高的微生物主要是草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、中间柠檬酸菌(Citrobacter intermedius)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)以及嗜热菌Symbiobacterium thermophilum和Symbi-obacterium toebii等。近年来，来源于上述微生物的TPL，其空间结构和作用机制已得到较深入研究，并在工业化应用方面取得重要进展。;三、实验原理;TPL的作用机理 TPL催化的β-消除反应机制主要包括以下步骤: 酶活性部位Lys257的ε-氨基与PLP共价结合形成内醛亚胺，内醛亚胺与底物 L-酪氨酸作用形成外醛亚胺，Lys257夺取外醛亚胺(底物)Cα质子产生醌型中间物，经底物Cγ质子化及Cβ-Cγ键断裂生成α-氨基丙烯酸中间物，α-氨基丙烯酸中间物进一步受与PLP结合的Lys257ε-氨基攻击再生TPL全酶 ;四、TPL 在 L-酪氨酸酶法合成中的应用;五、工艺路线; 工艺路线二 L-丝氨酸路线。由于L-丝氨酸可通过丝氨酸羟甲基转移酶(EC2．1．2．1)催化甘氨酸和甲醛廉价制备，Lee等用产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)和E．Herbicola ATCC 21434分别作为丝氨酸羟甲基转移酶和TPL的酶源，将以甘氨酸为底物合成L-丝氨酸的反应和以L-丝氨酸为底物合成L-酪氨酸的反应相偶联，反应体系含甘氨酸0．25mol/L、PLP0．5mmol/L、四氢叶酸0．7mmol/L、初始苯酚浓度0．32%，以37%甲醛启动反应16h后，可产生L-酪氨酸26．3g/L，甘氨酸转化率为61．4%，但该工艺存在甘氨酸对TPL抑制较强和操作复杂的明显不足。 ; 工艺路线三 S-邻硝基苯-L-半胱氨酸(SOPC)是TPL适宜的人工底物，其Vmax比生理底物L-酪氨酸高三倍，而Km仅为L-酪氨酸的50%。Phillips等以C．Freundii ATCC 29063细胞悬液作为酶源，4mmol/LSOPC和4mmol/L苯酚反应2h，苯酚的转化率就达到70%，而且这一反应的最适pH较为宽泛(6．8～9．0)。不过，SOPC价格较高，从而限制了该工艺的工业化应用。;L-酪氨酸的分析; 电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化以确定滴定终点的方法，和直接电位法相比，电位滴定法不需要准确的测量电极电位值，因此，温度、液体接界电位的影响并不重要，其准确度优于直接电位法普通滴定法是依靠指示剂颜色变化来指示滴定终点，如果待测溶液有颜色或浑浊时，终点的指示就比较困难，或者根本找不到合适的指示剂。电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示滴定终点。在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往连续变化n个数量级，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过消耗滴定剂的量来计算。;使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱滴定，氧化还原滴定，配合滴定和沉淀滴定。酸碱滴定时使用PH玻璃电极为指示电极，在氧化还原滴定中，可以从铂电极作指示电极。在配合滴定中，若用EDTA作滴定剂，可以用汞电极作指示电极，在沉淀滴定中，若用硝酸银滴定卤素离子，可以用银电极作指示电极。在滴定过程中，随着滴定剂的不断加入，电极电位E不断发生变化，电极电位发生突跃时，说明滴定到达终点。用微分曲线比普通滴定曲线更