[工学]微生物与基因工程.ppt

基因工程技术 基因工程（genetic engineering)：把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基因产物，或令生物表现出新的形状。 基因工程大事记 1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，实现了DNA的分子克隆; 1978 Genentech公司---人胰岛素---世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所-克隆羊多莉 1999.9 中国获准加入人类基因组计划, 负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 第一节 基因工程概述 三项重要技术为基因工程奠定了基础: 1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具； 1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功；1973年Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，实现了DNA的分子克隆; 1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽； 1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了三种DNA序列的快速测定法；90年代全自动核酸序列测定仪的问世； 一、基因工程基本过程 1、目的基因的提取：分离或合成外源基因。 2、体外重组：外源基因与载体体外连接，构建重组DNA分子； 3、转化：重组DNA分子导入细胞。 4、扩增该克隆DNA。 5、筛选与鉴定； 6、基因表达：控制适当条件，外源DNA表达。 7. 获得表达产物或转基因动物、转基因植物。 第二节 基因的分离合成和诱变 利用重组DNA技术，可将某一原核生物或真核生物染色体基因组的全部遗传信息，贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库(genomic library)或cDNA文库(cDNA library) 1. 基因文库的构建 所谓基因文库是指生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。 一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息（即全部DNA序列）。 2. cDNA文库构建 所谓cDNA文库是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。 由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但基于这样一个事实，即细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有15%左右基因被表达），因而若由mRNA逆转录为cDNA，那么所构建的cDNA文库的库容量相应比基因文库小。 构建cDNA文库的主要步骤： ①从生物体或细胞中提取mRNA。 ②利用逆转录酶以寡聚(dT)或随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA的第一条链。 ③利用DNA聚合酶I，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链;常用RNA酶H在杂交分子的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物;或是除去杂交分子的mRNA后，加入随机引物，即可合成第二条链。 ④cDNA与载体的体外连接。 ⑤噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cDNA不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。 基因的化学合成 DNA 的合成 自 DNA 合成仪问世后，化学合成已可完全自动化，在半个小时内可合成 30~35 个碱基的寡核苷酸。 目前化学合成寡核苷酸片段的长度约为 150~200 个核苷酸左右。 PCR 扩增技术的原理和应用 聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction, PCR ），是一种在体外快速扩增特定 DNA 序列的新技术。/video/2006/351.htm 如果 DNA 片段两端的序列是已知的，则先要合成一对寡聚核苷酸引物，它们各自与所需扩增的靶 DNA 片段的末端互补。 PCR 由 3 个基本反应组成。 ① 变性: 加热，模板 DNA 经热变性，成为两条单链； ② 退火: 使温度下降，寡核苷酸引物即与模板 DNA 中所要扩增序列两端的碱基配对； ③ 延伸: 在适宜条件下引物 3‘ 端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的 DNA 链。 DNA 片段以 2 的指数增长，重复 25~30 次循环，扩增的 DNA 片段拷贝数可增至 10 6 -10 7 倍。 PCR 技术的实