[工学]第九章 离心技术.ppt

设40000rpm时 R1最小、 3.8cm R2平均、 5.9cm R3最大、 8.1cm RCF值分别 67,910g 105,400g 144,700g 分析超离心的方法 分为沉降速度法和沉降平衡法. 沉降速度法据颗粒在离心场中移动速度 来测定其沉降系数、分子量或纯度等的方法称沉降速度法 . （1）沉降速度法（sedimentation speed）： ?????????????????????????????????????????? 沉降平衡法 用沉降平衡过程测定生物大分子的沉降系数或分子量的方法称沉降平衡法。 特点：低转速下的离心分析法，时间长（数小时至数日） 沉降平衡法 超速分析离心的应用 1.对生物大分子均一性估计 2.生物分子形状、大小、水合程度的估计 3.生物分子构象变化的检测 * 几种分子量测定方法的比较： 2.水平转子 （1）转子静止时,处在转子中的离心管中 心线与旋转轴平行,（2）转子旋转加速时,离心管中心线由  行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋 转轴成90°角,（3）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本 一致有少量的“管壁效应” 水平转子的特点：（1）转子的重心位置较高 （2）样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于 直径（3）对于多种成分样品分离特别有效 （4）常用于速率区带离心和等密度离心 （二）离心管 由管体和盖组件两部分组成 离心分离法 差速离心法 沉降速度法 速率区带离心法 等密度离心法 沉降平衡法 经典式沉降法 二、离心方法 差分离心（离心沉降）、密度离心法（离心分离） （一）差分离心 概念： 差分离心法亦称为“差速离心法”，是依据不同大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的不同进行离心分离的一项技术。 过程是将样品溶液在一定离心力场中离心一定时间使颗粒大组分沉降于管底，上层液再用加大的离心力场离心一定时间，又可获得中等大小的组分。如此依次提高离心力，逐级分离出所需组分，故称其为差分离心法。 用途： 差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于颗粒或密度差别较大的组分的分离，或其他分离手段之前的粗制品提取。 ? 例用差速离心法分离已破碎的细胞各组份 已破碎的细胞 500g,10分钟   沉淀 上清液 (细胞核） 10,000g,10分钟  沉淀 上清液 (细胞膜碎片,线粒体,) 100,000g,3小时 溶酶体   沉淀 上清液 (核糖核蛋白体） (可溶性成份)? （二）速度区带离心法 概念： 又称速率区带离心法或分级区带离心法。离心操作时将样品液置于连续或不连续，线性或非线性密度梯度液上（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），控制离心时间，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，从而达到彼此分离的目的。这种离心方法称速度区带离心法。 特点： （1）样品加于梯度介质的顶部、离心时间须严格控制。 （2）介质的密度亦须严格掌握：梯度最大值≤组分最小密度。 （3）样品的密度＜梯度密度最小值?。 （4）分离依据是各组分之沉降系数差。 （5）分辨率受组分沉降系数，离心时间，颗粒扩散系数，介质粘度及梯度范围和形状的影响。 用途： 本法适于分离颗粒大小不同而密度相近或相同的组分，如DNA与RNA混合物、核蛋白体亚单位及线粒体、溶酶体及过氧化物酶体等。 Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞 (一)　原理: 　　红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单核