[理学]WBL基因工程10.pptVIP

10 基因操作的主要技术原理 核酸的凝胶电泳 核酸分子杂交 细菌转化 DNA核苷酸序列分析 基因的合成与分离 基因定点诱变 基因扩增 基因操作的主要技术概述 重组DNA的实验方法中包括密度梯度、超速离心和电子显微镜 技术、DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、DNA序列结构分析以及基因的人工合成、基因定点突变和PCR扩增等多种新技术、新方法。 核心技术 DNA分子的切割与连接是基因操作的核心部分。 10.1 核酸的凝胶电泳 1．基本原理 2．琼脂糖凝胶电泳 3．脉冲电场凝胶电泳 10.1.1 核酸的凝胶电泳与原理 凝胶电泳： 琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺 (po1yacrylamide) 凝胶被于核酸分离研究,鉴定纯化DNA分子及蛋白 质与核酸相互作用。 基本原理： 当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。 核酸的凝胶电泳原理 由于在电泳中使用了无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。因此根据分子大小、构型或形状所带的净电荷的不同，便可各种成分分离开来。 凝胶电泳分离DNA片段的基本原理 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团，呈离子化状态。DNA和RNA的多核苷酸链则称多聚阴离子(po1yanions)。 当核酸分子在电场中时，会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。 溴化乙锭----核酸分子染色剂 在凝胶电泳中，加入溴化乙啶染料对核酸分子染色之后，在紫外光下观察，便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA谱带。 溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下放射出荧光，可用来显现凝胶中的核酸分子。 溴化乙锭扁平分子染料插入到核酸中 10.1.2 琼脂糖与聚丙烯凝胶电泳 琼脂糖是一种线性多糖，从红色海藻琼脂中提取而来的良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。 化学修饰的低熔点(LMP)的琼脂糖，因此在较低的温度下便会熔化，可用于DNA片段的制备电泳。 聚丙烯酰胺凝胶 凝胶分辨DNA片段的范围 琼脂糖：分辨DNA片段的范围为0．2—50kb之间。 聚丙烯酰胺：分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间。 凝胶浓度：浓度高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高， 孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 例如：20％的聚丙烯酰胺凝胶的分辨力可达l一6bp DNA小片 段，而要分离1000bp的DNA片段，则要用3％的聚丙烯酰胺的凝胶。 再如：2％的琼脂糖凝胶可分辨小到300bp的双链DNA分子，而 对于较大片段的DNA，则要用低浓度(0．3％一1．0％)的琼 脂糖凝胶。 凝胶电泳的优点 优点： 重要的分析的手段， 用来制备和纯化特定的DNA片段。 两种琼脂糖： 常熔点 低熔点，但价格相当昂贵。 琼脂糖特性： 琼脂的衍生物，具有很高的聚合强度和 很低的电内渗性，因此是良好的电泳支持介质 LMP琼脂糖凝胶的突出优点 LMP琼脂糖(熔点为62—65℃)一旦熔解，在37℃下持续保持液体状态达数小时，在25℃下可持续保持液体状态约10分钟。 LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收DNA分子。 一旦LMP琼脂糖已经熔化，并保持在37℃下，可直接进行一定的酶催反应。 在现代分子生物学研究及基因克隆实验中具有十分广泛的用途。 DNA分子的酶切消化与凝胶电泳分离 10.1.3 脉冲电场凝胶电泳 凝胶浓度的降低,孔径相应变大，但即便是浓度为 0．1％一0．2％的琼脂糖凝胶，亦不能分离分子量大于750kb的DNA大分子，况且这种情况的凝胶十分脆弱，极难操作。