蛋白质的修饰和表达2.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 分离纯化蛋白质是根据蛋白质的哪些性质进行的？举例说明3种层析的操作（解释溶液的盐离子浓度、PH值等变化）及其原理。 分子筛、离子交换和亲和层析是三种分离、醇化蛋白质的方法，你如何根据所要分离、纯化的蛋白质的性质选择使用。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 1.超速离心法 原理: 利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同,使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内,达到彼此分离的目的。 特点： 用超速离心或梯度密度离心法纯化蛋白,极难将某一蛋白成分分离出来，一般用于蛋白多聚合体的分离。 应用： 用于少部分大分子蛋白及蛋白多聚体和一些比较轻的物质的分离。 HBV-L多聚蛋白超速离心产物 蔗糖梯度离心产物 多聚蛋白的电镜检测 2.选择性沉淀法 原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。 常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用33～50％饱和度的硫酸胺。 盐溶现象：在盐溶液很稀的范围内，随着盐浓度的增加，球状蛋白质的溶解度也随之增加（图例），此现象称作盐溶(salting-in) 。任何物质的溶解度都取决于溶质分子间的相对亲和力及溶质分子与溶剂分子的相对亲和力。任何降低溶质分子相互作用的因素以及加强溶质分子与溶剂分子相互作用的因素都有助于增加溶解度。 盐析现象：随着盐浓度的继续升高，例如，达到饱和和半饱和的程度，蛋白质的溶解度逐渐变小，彼此之间相互凝聚而发生沉淀，此现象称作盐析(satting-out) 。 特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。 应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。 3. 凝胶过滤层析法 原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质， 经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种 分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时 间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝 胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分 成大、中、小三种类型。 凝胶过滤层析过程示意图 凝胶过滤层析过程示意图 凝胶过滤层析过程示意图 优点 条件温和 操作简便 损失少回收率高 层析柱可反复使用 4.离子交换层析法 原理： 利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使蛋白质分成几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。 离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。 带有SO3－ 或COO－基团，通常以SO3－Na＋ 或COO－H＋形式出现的叫做阳离子交换基； 带有N＋（C2H5）基团通常以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做阴离子交换基。 阳离子交换基 阴离子交换基 蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH值。 当pI pH时，蛋白质带净负电荷；而当 pI pH时，蛋白质带净正电荷。 阳离子交换层析过程 离子交换树脂 高离子强度洗脱液洗 高离子强度洗脱液洗 5.亲合层析法 原理： 依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。 配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。 优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性 含配体溶液 收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白 混合蛋白样品 平衡液 带有配体的树脂珠（或胶粒） 亲和层析法示意图 6.反相色谱（reversed phase chromatography，RPC）和疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC） 反相色谱和疏水色谱是