DNA扩增标准化操作规范.docVIP

1 目的：DNA 扩增标准化操作规范适用于HLA试验中的DNA 扩增操作。 2 适用范围：DNA 基因分型实验室。 3 依据：DNA 扩增标准化操作规范 4 引用文件：德国BAG公司（以下简称BAG）《Instructions for use Instructions for use HISTO TYPE/DNA -ABDR 384》 5 程序 5．1 试剂准备 5.1.1 BAG? 384 试剂包,包括扩增板、Buffer、读板纸、说明书 5.1.2 灭菌蒸馏水 5.1.3 Taq酶 5.2 仪器及用具准备 5.2.1 移液器规格：1-10μl ,20-200μl ,200-1000μl 5.2.2 电动连续加样器 5.2.3 移液器配套吸头，要求灭菌 5.2.4 离心管：1.5ml，要求灭菌 5.2.5 水平式离心机 5.2.6 配套384板的DNA 扩增仪 5.2.7 石腊油、平皿 5.2.8 中性记号笔 5.2.9 手套，规格：乳胶手套，与操作者手形相适应，经灭菌 5.3操作步骤： 5.3.1 换工作服、戴手套 5.3.1.1 从工作服衣柜中换取专用工作服，戴上适应自己手形的乳胶手套。 5.3.2 扩增混合液的配置 5.3.2.1 选择DNA 浓度要求大于20ng/μl,A260/A280要求在1.60 至2.0之间的DNA 方可 每4个DNA 样品为一组。 5.3.2.2 核对DNA 抽提记录，确认需要扩增的DNA 号码正确无误 5.3.2.3 计算每个混合液的组成： Buffer：106μl DNA 量原则：要求每个样本有5-8μgDNA ，一般原则如下： DNA 浓度（ng/μl）DNA 量(ul) 10 ― 40 200 40 ― 80 102 80以上70 酶每个样本DNA 要求35U,酶量计算公式：酶量= 35/ 酶活性单位/μl H2O量计算：H2O量=1060-酶量-buffer-DNA 量 混合液总体控制在1060μl左右 记录以上配制信息 5.3.2.4 取1.5ml 离心管，按照配制记录上DNA 顺序放置DNA 和空禍 1c84 ????????夸???????訮??????種??A 号到对应的空离心管上 5.3.2.5 检查确认空离心管上的DNA 号码准确无误 5.3.2.6 按照配制记录，以（1）Buffer（2）H2O（3）Taq酶（4）DNA 的顺序依次将各反应成分加入离心管中，要防止交叉污染。注意（1）（2）（3）三种成份，每加入一种成份换一次枪头，DNA 模板每加一管换一次枪头。盖上离心管的盖，混匀。 5.3.2 加样扩增 5.3.2.1 从-20的冰箱中拿出384干板放于室温一段时间，待干板回到室温后，用油性记号笔在6列和7列、12列和13列、18列和19列之间各画一条记号线进行样品间的划分。调节连续加样器，使每次加样的量为10μl,可以连续加样10―50次。从每个样品的左上第一孔连续加入10μl。注意加样的枪头不要与底部的引物接触，以避免带入其他孔的引物而影响实验结果。因此，加样时，应加在靠近孔口处，让液体自然流下。 5.3.2.2 加样完成后，使用粘性耐热膜封严384干板。先打开耐热膜的一端，对应的贴在384干板的一端，然后沿贴的一端，一边打开耐热膜，一边紧紧的贴在板上，最终整块粘性耐热膜完全牢牢粘贴在384干板上。用记号笔在板上正确记录样品号，保证无误后，2000rpm离心5分钟。如果不是马上扩增，可以加样后暂不离心，放入冰箱保存，待扩增时再离心，但时间不宜过长。 5.3.2.3 扩增前，取出干板，放到PCR头上，保证孔对孔；加盖胶垫，拧紧PCR头的盖子上的旋钮，以操作者感到旋钮吃紧即可。设定指定的扩增程序即可扩增。 5.3.2.4 约100分钟后，扩增完成。打开PCR仪热盖，取下384板，放入冷藏冰箱或立即电泳。 5.3.2.5 关上PCR仪。