[生物学]测序指南优化应用与故障排除.pdf

DNA测序 反应条件优化、故障排除与应用 陈云地 8008100192 ，021407 chenyd@ 2004年 1 DNA测序反应条件优化 DNA测序基本流程 ☯ 准备模板：质粒、PCR产物 ☯ 抽样检查DNA浓度和质量，必要时纯化 ☯ 测序PCR反应 ☯ 纯化测序产物 ☯ 配制电泳样品，变性 ☯ 上机电泳 ☯ 分析数据 3 20 µL 标准反应体系 测序反应 DNA 1 µL BigDye 8 µL 引物(3.2 pmol / µl) 1 µL 去离子灭菌水 10 µL 总体积 20 µL 测序PCR循环条件 96 °C 1 min → (96 °C 10 sec →50 °C 5 sec →60 °C 4 min) x 25个循环 →4 °C保温 4 BigDye稀释方法 BigDye是2.5 x 的 Sequencing Buffer是5 x 的 试剂用多少并不重要，重要的是 在任何反应体系中，BigDye 的终浓度必须是1 x 的 如果BigDye本身浓度不够，则 BigDye + Sequencing Buffer = 1 x 反应体积的大小并不重要， 重要的是在PCR过程中反应体积不要有波动（蒸发） 高质量的管子和管盖是防止蒸发的关键 较大的反应体积可以减小蒸发的影响 5 20 µL ½反应体系 测序反应 DNA 1 µL BigDye (2.5x) 4 µL Seq Buffer (5x) 2 µL 引物(3.2 pmol / µl) 1 µL 去离子灭菌水 12 µL 总体积 20 µL 测序PCR循环条件 96 °C 1 min → (96 °C 10 sec →50 °C 5 sec →60 °C 4 min) x 25个循环 →4 °C保温 6 10µL½反应体系 测序反应 DNA 1 µL BigDye 4 µL 引物(3.2 pmol / µl) 1 µL 去离子灭菌水 4 µL