大鼠DRG教材教学课件.pptxVIP

大鼠背根神经节神经元的分离方法及电生理特征探讨 连宇一、摘要 在获取大鼠背根神经节神经元后，全细胞膜片钳技术记录动作电位和钠电流，探讨大鼠背根神经节细胞的分离方法和细胞形态以及电生理特征。结果显示在背根神经节细胞上记录的动作电位呈正立锐角三角形，静息电位小，动作电位时程短。背根神经节神经元的钠通道最大电流密度为（-62.04±4.45） pA/pF，几乎能被河豚毒素（TTX）完全抑制。背根神经节（Dorsal Root Ganglion，DRG）神经元是一类具有假单极结构特征的初级感觉神经元，外周感觉信息起始于它的外周末梢并从外周向中枢传导至脊髓背角，借中枢末梢释放的神经递质作用于突触后靶细胞，对感觉信息进行初步加工，完成初级感觉信息的传递。由于DRG 神经元在痛觉信息传递中起着特别重要作用， 所以在DRG 细胞膜上促使动作电位产生传导痛觉信息的主要离子流—— 电压门控性钠通道的研究正受到国内外研究者越来越多的追捧。因此，分离好的DRG 神经元， 认知DRG 神经元的好坏状态， 区分DRG 神经元的电生理特性就显得尤其重要。本文首次系统介绍了DRG 神经元的急性分离方法及认知活的神经元好坏形态， 采用全细胞膜片钳技术记录DRG 神经元离子通道电生理特征， 目的是使借助DRG 神经元从事膜片钳技术实验者能够正确判断和认知DRG 神经元及其特征。二、材料与方法2.1 实验动物与溶液试剂幻灯片 62.2 分离单个DRG 神经元幻灯片 72.3 全细胞膜片钳记录幻灯片 82.4 动作电位和钠电流的记录过程幻灯片 102.5 统计学处理实验动物均选为出生后30 d 左右的雄性成年Wistar 大鼠，体重100～150g。记录动作电位的电极外液和内液分别采用记录INa的电极外液和内液。胶原酶II、胰蛋白酶（type III）、胰蛋白酶抑制剂（type II-S）、等。幻灯片 5动物在麻醉断头后，钝性分离带有棘突和横突的胸腰段脊柱，置于细胞外液中，用显微外科剪和显微外科镊仔细剪除与脊柱相连神经和周围的结缔组织被膜、棘突和横突，暴露椎间脊髓，牵起脊髓露出膨大附着后根的DRG，大小约1 mm，表面光滑，小心用显微外科剪剪去DRG 两端的脊神经干， 保留膨大部分， 就是DRG体。用塑料滴管吸取DRG 体，移到另一个培养皿中，尽可能地剪碎DRG 体，后加入胰蛋白酶I 型（0.5 mg/mL），胶原蛋白酶II 型（1.0 mg/mL），并将培养皿置于恒温振荡水浴器（35℃，80 次/min）中振荡、孵育45 min，显微镜下观察出现单个DRG 神经元后，加入胰蛋白酶抑制剂（1.25 mg/mL）终止酶的消化作用，再将DRG神经元置入离心机离心，后静置30 min，待细胞贴壁。幻灯片 5保持室温22～26℃，将盛有单个DRG 神经元的细胞记录槽置于倒置显微镜 载物台上，观察DRG 神经元的形态、大小、状态的优劣度，选取直径20~40 μm、胞膜完整、胞质清晰的优质DRG 细胞作为记录对象，用全细胞膜片钳记录方法对细胞进行钳制，脉冲信号由Pulse+Pulsefit 软件（version 8.31，德国HEKA 公司）控制，经EPC-9 放大器（德国HEKA 公司）放大后通过Ag-AgCl 电极丝和被填充记录动作电位或INa电极内液的玻璃微电极导入细胞，产生的电流信号经EPC-9 放大器转换，信号为Pulse 软件收集并存储于计算机的硬盘中。采用Igor Pro 分析软件（version 3.31，美国）对实验图形进行拟合分析处理并应用到论文中。3.2 DRG 神经元的动作电位特征 在DRG 细胞上记录的动作电位都是典型的，均具有从0期到4 期，呈正立锐角三角形态（n=8）（图2（a）），与记录正常心室肌细胞动作电位的形态相比[5]，DRG 细胞的动作电位没有心肌细胞动作电位所特有的2 相平台期（图2（b））。3.3 DRG 神经元的钠电流特征当对DRG 细胞进行INa记录时， 可见内向性电流在-60mV 开始激活，-30 mV 达到最大值，然后开始减小，最大电流密度为（-62.04±4.45） pA/pF（图3（a））。给予TTX（30 μmol/L）作用细胞5 min，可见各钳制电压下的电流均显著减小，最大电流密度为（-7.32±2.23）pA/pF（与对照组相比P0.01，n=8)（图3（b）），证明本实验所记录的内向性电流为INa。在TTX 作用之后，改用记录钠通道的细胞外液冲灌细胞，发现最大电流密度又恢复到接近用药前的水平，变为（-54.23±2.87）pA/pF（与对照组相比，P0.05，n=12）（图3（c）），表明TTX 对DRG 神经元细胞的INa的抑制作用是可逆的。四、讨论 利用膜片钳技术探讨神经系统疾病发生的电生理特征及其药物作用