琼脂糖凝胶电泳分离dna片段中南民族大学.pptVIP

Your company slogan LOGO 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 1 实验目的 2 实验原理 3 仪器与试剂 4 实验步骤 5 注意事项 药学院 化学生物学教研室 1.实验目的 学习用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度、浓度、构型及其相对分子质量大小的方法。 药学院 化学生物学教研室 2.实验原理 text1 text2 text3 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快捷，可以分辨用其他方法（如密度梯度离心法）无法分离的DNA片段。用低浓度的嵌入式荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下可以检出1~10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离1kb以下的小片段DNA效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳速率快，容量相对较大，采用垂直装置进行电泳，但制备和操作比琼脂糖凝胶电泳困难，常用于核酸的序列测定。琼脂糖凝胶电泳的分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，但其分离范围广，不同浓度的琼脂糖凝胶电泳可分离DNA片段的范围为200bp~50kb，通常在水平装置上进行，操作简便。 药学院 化学生物学教研室 3.仪器与试剂 （1）天平 （2）电炉 （3）制胶槽 （4）电泳仪 （5）电泳槽 （6）荧光成像仪 （7）移液枪 仪器 text2 试剂 （1）0.5 × TBE 电泳缓冲液：54g Tris、27.5g硼酸、3.72g二水合EDTA二钠盐，用水定容至1000mL。使用时稀释10倍。 （2）EB溶液：称取EB溶于无菌水中，母液浓度1mg/mL，4℃避光保存。 （3）相对分子质量标准（100bp，DNA标准物） （4）6 ×点样缓冲液（0.25%溴酚蓝，400g/L蔗糖） （5）琼脂糖 （6）扩增好的毛囊DNA样品 药学院 化学生物学教研室 4.实验步骤 （5） 电泳 （4） 点样 （3） 装配 （2） 制胶 （1） 溶解 药学院 化学生物学教研室 4.实验步骤 （1） 称取0.4g琼脂糖于150mL三角瓶中，加 入20mL 0.5×TBE电泳溶液，置电炉上加热溶解（注意要经常晃动，避免过热溢出！），制成2%琼脂糖溶液。 琼脂糖 药学院 化学生物学教研室 4.实验步骤 （2）将琼脂糖溶液冷却至60℃左右，加入5μL浓度为1mg/mL的EB溶液（戴手套！），摇匀，立即小心倒入准备好的胶模槽中（已插好梳子），使琼脂糖溶液在槽中的厚度为3~5mm，排除梳齿上的气泡（一般轻轻抖动梳子或用小针头挑一下即可）。 药学院 化学生物学教研室 4.实验步骤 （3）室温下放置30~40min，使凝胶完全凝固后，加入少量0.5×TBE电泳缓冲液，小心拔出梳子，将胶膜放入电泳槽中（注意加样端接负极），加入适量0.5× TBE电泳缓冲液，使液面高出胶面约1mm 药学院 化学生物学教研室 4.实验步骤 （4）用移液枪取10μL PCR扩增样品和2μL点样缓冲液混匀，用移液枪将样品加入凝胶的加样孔中，注意枪头不可穿透孔底。另取10μL相对分子质量标准液（已和加样缓冲液混匀），同法加样至另一泳道的加样孔。记录样品点样顺序（泳道）与点样量。 药学院 化学生物学教研室 4.实验步骤 （5）开启电源开关，接通电泳槽和电泳仪，注意DNA向正极移动，加样端要接负极。调节电泳电压为100V。在电泳途中可用紫外灯直接观察，DNA各条区带分开后，电泳结束。 药学院 化学生物学教研室 5.注意事项 （1）EB为强致癌物，注意避免接触皮肤，使用时一定要戴手套。 （2）紫外光对眼睛有害，观察电泳结果时最好戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察。 WARNING 药学院 化学生物学教研室 6.思考题 简述琼脂糖凝胶和EB染料在电泳分离DNA中的作用。 药学院 化学生物学教研室 Your company slogan LOGO