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液谱基础知识培训教案 一、液谱的发展特点 1、定义，发展时间， 引用的技术 应用的范围 目前的市场状况。 2、特点 a. 高压 （150---350）Kpa b. 高速 氨基酸 一小时几十种 c. 高效 分离效率高 气谱柱效2000塔板/米 液谱柱效3万塔板/米 d. 高灵敏度 １０（－９克） e. 应用范围广 （70~80%） 二、高效液相色谱的结构 １ 、储液装置 ２、高压泵 （150~350）×105 kpa a.恒压泵　　（气动放大泵） . b.恒流泵 　（往复式柱塞泵）图形　 单泵的缺点，应用双泵 　　　　 流量稳定,无脉冲 高效液相色谱的结构 ３：梯度洗提装置：就是载液中含有两种或更多不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。 ⑵外梯度：梯度洗提可以采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱，这种叫做低压梯度，也称外梯度。 ⑶内梯度：梯度洗提可以将溶剂利用高 压泵增压以后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合后送入色谱柱，即所谓高压梯度或内梯度系统。 高效液相色谱的结构 梯度洗提的优点： 1.改善分离; 2.改善峰形 ; 3.加快分析速度; 4.提高柱; 5.增加峰高量. 梯度洗提的缺点：下次分析时更换流动相需要时间. 高效液相色谱的结构 ４、进样装置 　六通阀　　 ５、色谱柱 目前液相色谱常用的标准柱型是内径为4.6~3.9 mm，长度为15~30cm的直形不绣钢柱。填料颗粒度5~10μm，液相色谱柱发展的一个重要趋势是减小填料颗粒度（3~5μm）,以提高柱效，这样可以使用更短的柱，更快的分析速度。 液相色谱的装填方法有干法和湿法两种。干法：装填颗粒度大于20μm 的可用和气相色谱柱相同的干法装柱。湿法：装填粒度小于20μm 的微颗粒填料装柱用湿法装柱。 高效液相色谱的结构 5、检测器 （ 紫外吸收检测器） 图３ 要求：高灵敏度；重现性好；响应快；线性范围宽；适用范围广；对流动相流量和温度波动不敏感；死体积小。 原理：基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比耳定律。 缺点：（1）对紫外光不吸收的试样不能分析 ； （2）溶剂的选用受限制（如苯，紫外光不能透过）。 高效液相色谱的结构 最大吸收波长的选择，即当试样组分通过流通池时，短时间中断液流进行快速扫描，以得到紫外吸收光谱，为定性分析提供信息，据此选择最佳检测波长。 1、光源 ：低压泵灯、氘灯、荧光源。 2、吸收池。 三、高效液相色谱的分类 1、液液分配色谱 试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配。 物质间的分配服从于下式：K=Cs/Cm　　 　　分配系数大小的影响 高效液相色谱的分类 2、液固吸附色谱 流动相为液体，固定相为吸附剂，根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是溶质分子（X）和溶剂分子（S）对吸附剂活性表面的竞争吸附，可用下式表示：Xm +nSa=Xa×nSm 式中Xm和Xa分别表示在流动相中和被吸附的溶质分子，Sa代表被吸附在表面上的溶剂分子，Sm表示在流动相中的溶剂分子。n 是被吸附的溶剂的溶剂分子数。溶质分子X被吸附，将取代固定相表面上的溶剂分子，这种竞争吸附达到平衡时，可用下式表示：K=［Xa］［Sm］/［Xm］［Sa］ 　　　吸附平衡系数，也称分配系数 高效液相色谱的分类 3、离子交换色谱法 基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。 用Ｄ表示分配系数 高效液相色谱的分类 4、空间排阻色谱法 （凝胶层析） 空间排阻色谱法以凝胶为固定相。它的分离机理类似于分子筛的作用，具有大小不等的孔穴分布，当样品进入色谱柱，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子并首先在色谱图上出现，；另外一些 很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色