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? 生物化学实验报告论文????????????? 班级:质量121???????????????? 学号:20120844119???????????????? 姓名:张瑶瑶一、前言??????? 生物化学是一门联系生物和化学的一门科学学科，学习生物化学可以提高我们严谨的科学分析以及熟练的实验操作，本文主要讲了金黄色葡萄球菌核糖核酸酶的分离实验，金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，属于葡萄球菌属，可引起许多严重污染，本文主要通过核酸酶活性的测定，考马斯亮蓝法测定蛋白质溶液浓度，DEAE-纤维素的处理及装柱，蛋白质亚基分子量测定SDS凝胶电泳?二、实验材料准备????????? 共分为四组，了解实验目的、方案?? 、原理? 。??????? 2.1、取已配制好的金黄色葡萄球菌于离心管内，8000 rpm离心除掉菌体，保留上清（留1-2ml,p1）,用作后续实验。???? 2.2 、将锥形瓶中的金黄色葡萄球菌液体放到沸水中煮30分钟，10000rpm?? 离心，保留上清液（留1-2ml,p2）,用作后续实验。???? 2.3、将离心好的上清液取60ml进行75%硫酸铵饱和度沉淀实验，放置离心管，配平后4度冰箱中放置24小时。将硫酸铵沉淀液10000rpm离心，去上清，保留沉淀，缓冲液洗涤，方法是在第一支离心管中加入2ml缓冲液混匀倒入第二支离心管中，再取2ml于第一支离心管中洗一次，再倒入第二支离心管中，最后在第二支离心管中再加入2ml缓冲液。终体积为6ml（留0.5ml,p3）。???? 2.4、DEAE-纤维素的处理及装柱???? 2.4.1、处理???? 本实验采用的是DEAE-纤维素DE52是弱酸型阴离子交换剂，具体处理方法为:先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的Hcl溶液中浸泡1h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH4以上，并将其在抽滤中抽干；将抽干的离子交换剂浸在0.5N的?NaOH溶液中1h,再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。???????? 2.4.2、装柱????????? 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱才，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部；凝胶沉积至高度10cm处，停止装柱；夹上止液夹。????????? 2.4.3、平衡????????? 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时（大于50ml平衡液），层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.001M Tris-HCl缓冲液PH9.0（内含0.0001M EDTA）,预先将DE-52柱进行平衡。???????? 2.5、上样????????? 平衡液50ml用于收集，收集30-40ml即可。然后装入透析袋，PEG2包埋，浓缩。收集浓缩液p4-x；??????? 2.6、透析袋预处理??????????? 新的透析袋在沸水中煮沸10min.即可进行透析。?三、核酸酶活性的测定??????????? 将甲苯胺蓝核酸琼脂溶化后，倒入平板中，凝固后，用直径为2mm的打孔器打孔，将琼脂取出，将待检酶液10ul,滴入孔中，置于加有湿棉纱的湿盒内，在37℃培养4h,阳性反应在孔的周围会出现1mm以上的粉红圈，测量粉红圈的直径。四、? 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度?????????? 4.1、实验原理??????????? 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高度敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm,考马斯亮G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高度敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝 G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可用于蛋白质浓度的测定。???????? 4.2、实验仪器及用品????????? 实验试剂:（1）水；（2）标准蛋白液:牛血清蛋白（0.1mg/ml）;（3）染液:考马斯亮蓝G250（0.01%）,称取0.1g考马斯亮蓝G250 溶于50ml95%乙醇，再加入100ml浓磷酸，加蒸馏水定容到1000ml;（4）样品液:取牛血清白蛋白（0.1mg/ml）溶液，用0.9%NaCL稀释至一定浓度。???????? 4.3、实验内容及步骤???????? 4.3.1、标准曲线的绘制???????? 4.3.2、取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂??试剂1234567标准蛋白液（ml）00.10.20.40.60.80.8样液S水(ml)1.00.90.80.60.40.20.2考马